منابع و ماخذ مقاله صنعت دارو

دانلود پایان نامه

ه در نتيجه اثرات زيان آوري را به دنبال خواهد داشت. در نتيجه اين تغيير، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول شود. علاوه بر آن، اين تغيير ممکن است منجر به تجزيه ترکيبات سطحي غشا شود (هولت، 1984). بنابراين حفظ سلامت غشا براي توليد اسپرماتوزواهاي با كيفيت بعد از انجماد بسيار اهميت دارد. کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول در حين انجماد اسپرم در سال 1949 ميلادي توسط پولژ باعث شد که بتواند براي اولين بار اسپرم حيوانات را منجمد کند. اينکه چگونه گليسرول باعث حفظ اسپرم در حين انجماد ميشود يک پديده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانيسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گليسرول قابليت نفوذ پذيري بالايي داشته و اثر درون سلولي از خود نشان ميدهد. براي مثال اثر آبکشي شديد و بالاي گليسرول باعث کاهش تشکيل کريستالهاي يخ درون سلولي ميشود. مکانيسمي که گليسرول باعث آبکشي و کاهش دماي انجمادي ميشود به پتانسيل بالاي پيوند آبي آن مربوط ميشود که درنتيجه غلظت الکتروليتهاي آزاد شده افزايش يافته و ساخته شدن کريستالهاي يخ به تأخير افتاده و يا مقدار آن کاهش مي يابد که در نتيجه اسپرم در مقابل تغييرات فشار اسمزي و غلظتهاي نمک محافظت ميشود(مکلاگين و همکاران، 1992). علاوه بر گليسرول، دي متيل سولفوکسايد و اتيلنگلايکول هم استفاده ميشوند که داراي وزن مولكولي كم هستند و عوامل محافظ انجمادي درون سلولي يا نفوذ کننده7 ناميده ميشوند.
منابع ليپوپروتئيني يا مواد با وزن مولکولي بالا مثل زردهي تخم مرغ، شير يا لسيتينسويا براي جلوگيري از شوک سرما8 و گلوکز يا فروکتوز به عنوان منابع انرژي و ساير افزودنيها مانند آنزيمها و آنتي بيوتيکها به رقيق کننده اضافه ميشود(بلکشاو، 1995). براي تقويت رقيقكنندهها معمولا از تركيبات با منشا حيواني نظير زرده تخممرغ و شير كامل استفاده ميشود. اين رقيق کنندهها قادرند احتياجات مورد نياز اسپرم را که در بخشهاي قبلي ذکرشد، تامين کنند. زرده تخم مرغ نيز يک جزء معمول تشکيل دهنده محيطهاي انجماد است و با عمل بر روي غشا سلولي، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت ميکند، اما اين رقيق کنندهها مشکلاتي نيز با خود دارند به طوريکه درسالهاي اخير بحثهاي زيادي را به خود اختصاص دادهاند. يکي ازاين مشكلات، تغييرات زياد درترکيبات آنهاست به طوريکه استاندارد سازي هر يك از اجزاي وي‍ژه و مفيد موجود در آن رقيق كننده بر خصوصيات انجمادي اسپرم را با مشکل مواجه ميکند. علاوه بر اين زرده تخم مرغ و شير ممکن است حاوي آلودگيهاي ميکروبي باشند که با توليد سموم، ظرفيت باروري اسپرماتوزوا را شديدا کاهش داده و حتي باعث از بين رفتن آنها شوند و از همه مهمتر اينکه باعث انتقال بيماريهايي مثل آنفولانزاي مرغي شوند. از ديگر مشکلات زردهي تخم مرغ وجود مواد مضر از قبيل پروژسترون است که سبب ظرفيت دار شدن زود هنگام9 اسپرم در طي انجماد ميشود. در محيط داراي زردهيتخم مرغ به علت وجود مواد اضافي، مشاهدات ميکروسکوپي اسپرم دشوار است. همچنين مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرمها يا کاهش تحرک آنها ميشود و نيز سموم اندوتوکسين توليدي توسط آلودگيهاي موجود در زرده تخممرغ باعث کاهش باروري اسپرم ميشود. بنابراين آلودگيهاي مايکوپلاسمايي و باکتريايي موجود در منابع حيواني مورد استفاده در انجماد مني و گسترش منيهاي منجمد گونههاي مختلف در سطح جهان همواره نگراني گسترش بيما‌ري‌هايي مانند جنون گاوي و آنفلوآنزاي مرغي را در سطح جهان در پي داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: اميرات و همکاران، 2004). فراواني منابع گياهي و عدم وجود آلودگي منابع گياهي اين ضرورت را ايجاد ميکند که اين منابع جايگزين منابع حيواني گردد، به طوريکه منابع گياهي به ويژه لسيتينسويا در مطالعات زيادي براي انجماد اسپرم گونههاي مختلف استفاده شده است که در فصل پيشينه تحقيق به طور کامل بررسي شده است.
1-3- هدف آزمايش
هدف پژوهش حاضر، بررسي استفاده از سطوح مختلف زرده تخم مرغ و لسيتين سويا در رقيق کننده دست ساز و انتخاب بهترين سطوح ليپوپروتئينهاي حيواني و گياهي در رقيق کننده مني قوچ، ارزيابي اثر آن بر خصوصيات جنبايي، زنده ماني و يکپارچگي غشاي اسپرم قوچ در طي انجماد- ذوب بود. لسيتين سويا10 به عنوان منبع گياهي و زرده تخممرغ به عنوان منبع حيواني در يک محيط پايه11 براي انجماد اسپرم قوچ در نظر گرفته شدند. بنابراين اهداف اين پژوهش شامل:
1- بررسي اثر غلظتهاي مختلف لسيتين سويا (5/0، 1، 5/1 و2%) روي جنبايي، زنده ماني، يکپارچگي غشاي پلاسمايي و مورفولوژي اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب
2- بررسي اثر غلظتهاي مختلف زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و 20%) روي جنبايي، زنده ماني، يکپارچگي غشاي پلاسمايي و مورفولوژي اسپرم بعد از فرآيند انجماد-ذوب
3- توليد يک رقيق کننده دست ساز پايه و مطلوب براي انجام مطالعات بعدي انجماد مني
1-4-پرسش اصلي تحقيق (مساله تحقيق):
از بين دو نوع منبع لسيتين شامل زرده تخم مرغ و لسيتين سويا به عنوان محافظت کننده در برابر شوک سرما كدام يك از آنها و در چه سطحي جهت استفاده در محيط انجماد اسپرم قوچ افشاري در داخل فصل توليدمثل مناسب هستند؟
فصل دوم
پيشينه تحقيق
2-1- حفظ انجمادي
حفظ انجمادي12 اسپرم ابزار مفيدي براي مطالعات جنين شناسي آزمايشگاهي و تلقيح مصنوعي13 است و بخش اساسي و ضروري در فناوري هاي توليد مثل به حساب مي آيد. حفظ انجمادي به معناي ذخيره مواد بيولوژيک از جمله اسپرم در زير نقطه انجماد آب است، به گونهاي که اين مواد از بين نروند و جهت ذخيره طولاني مدت اسپرم براي لقاح آزمايشگاهي، مهندسي ژنتيک و تلقيح مصنوعي استفاده شود (ماتسوکا و همکاران، 2006).
2-1-1- کاربرد و فوايد حفظ انجمادي مني
حفظ انجمادي يک روش حفظ ژرم پلاسم14 است که در بخشهاي کشاورزي، آبزي پروري15، بيوتکنولوژي و حفظ گونههاي در معرض انقراض کاربرد دارد(اندرابي و همکاران، 2007). در بخش کشاورزي، حفظ انجمادي ژرم پلاسم براي بهبود ژنتيکي گونههاي اهلي، حفظ نژادهاي کمياب و مبادلات بين المللي ژرم پلاسم استفاده ميگردد. هم چنين حفظ انجمادي ژرم پلاسم، براي توليد و حفاظت از حيوانات تراريخته16 ضروري است و در بسياري از مطالعات پزشکي، به ويژه در زمينه ايمونولوژي، ويروسشناسي، نوروبيولوژي، سمشناسي و صنعت داروسازي کاربرد دارد. در مورد گونههاي در معرض انقراض، حفظ انجمادي مواد ژنتيکي براي برنامههاي مديريت ژنتيکي آن گونهها و ذخيره منابع ژنتيکي استفاده ميشود (هرارا و همکاران، 2006). در قوچ نشان داده شده است که مني منجمد ذخيره شده در طول 27 سال، باروري را تحت تاثير قرار نميدهد، که اين باعث حفظ منابع ژنتيکي نژادهاي بومي مي‌شود(سالامون و ويزر، 1972). امروزه، حفظ انجمادي مني کاربردهاي بيوتکنولوژيکي بسياري دارد، از آن جمله که ميتواند براي درمان مشکلات کم باروري17 انسان، بيماريهاي تهديدکننده حيات، حفظ مني و DNA گونههاي در خطر انقراض و حفظ تنوع زيستي18 مورد استفاده قرار گيرد.
2-1-2- انواع روشهاي حفظ انجمادي
دو روش ميتواند براي حفظ انجمادي گامت استفاده شود: انجماد آهسته و انجماد سريع19. انجماد آهسته با استفاده از غلظت کم محافظت کنندهها انجمادي همراه است که به سميت مواد شيميايي و شوک اسمزي مرتبط است. انجماد سريع يا ويتريفيکاسيون يک روش سريع که باعث کاهش شوک سرمايي ميشود، اما معمولا براي اسپرم انجام نمي‌شود، چون انتقال دما20 در سلولهاي اسپرم خيلي آهسته است که امکان انجام ويتريفيکاسيون را بدون اين که خطرات ناشي از اثرات محلول يا تشکيل بلورهاي يخ را براي اسپرم داشته باشد، بدهد(بارباس و همکاران، 2009). معمولا، حفظ انجمادي شامل کاهش درجه حرارت، از دست دادن آب سلولي21، انجماد و ذوب ميباشد(مک لاگين و همکاران، 1992). نرخ انجماد بايد به اندازه کافي آهسته باشد تا اجازه دهد آب از سلولها توسط روش اسمز خارج شود تا از تشکيل کرسيتالهاي يخ داخل سلولي که باعث صدمات برگشت ناپذير به سلولهاي اسپرم ميشود، جلوگيري شود.
2-1-3- تاريخچه حفظ انجماد مني قوچ
مطالعات بر روي تلقيح مصنوعي در گوسفند، در ابتداي قرن بيستم توسط ايوانف آغاز شد. اين مطالعات بر روي رقيق کنندهها و روشهاي رقيق سازي منجر به کاربرد آزمايشي تلقيح مصنوعي در گوسفند شد. بعد از جنگ جهاني اول مطالعات گسترده تري تحت رهبري ميلووانف آغاز شد و در اوايل سال 1930، تلقيح مصنوعي با استفاده از مني تازه و رقيق شده براي توليد انبوه گوسفندها با استفاده از مني قوچهاي با نژاد برتر، انجام شد. بارور نمودن همزمان تعداد زيادي ميش با استفاده از اسپرم قوچ هاي با نژاد برتر، نيازمند انتقال مني از مرکز توليد و جمع آوري به مزارع در فواصل دور است. همچنين امکان استفاده از اسپرم در زمانهاي مختلف سال، مشوق محققان براي ذخيره اسپرم در شرايط آزمايشگاهي شد. براي اين منظور بايد از روشهايياستفادهميشدکه با کاهش يا توقف متابوليسم، عمر باروري22 اسپرمها افزايش مي‌يافت(سالامون و مکسول، 2000). بر اين اساس محققين دو راه براي ذخيره اسپرم پيشنهاد نمودند:
اولين روش بر اساس نگهداري آنها در حالت مايع و کاهش دما به 10-5 و يا 15-10 درجه سلسيوس بود. در اين محدوده دمايي متابوليسم اسپرم به شکل برگشت پذيري متوقف ميشود. زماني که اسپرمها در دماي نزديک به صفر درجه سلسيوس نگهداري شوند، شوک سرمايي ميتواند تغييرات برگشت ناپذيري را در اسپرمها ايجاد کند و با افزودن ليپيدها به رقيق کننده و با سرد کردن تدريجي از دماي اتاق مي توان مانع ايجاد شوک سرمايي در اسپرم ها شد. نگهداري در حالت مايع تنها براي نگهداري و ذخيره کوتاه مدت امکان پذير بود. اين امر موجب شد تا محققين روش‌هاي مبتني بر کاهش دما به زير صفر درجه سلسيوس، که در آن اسپرم مدت زمان بيشتري نگهداري مي شود را جستجو کنند. مطالعات بر روي اثرات دماي زير صفر درجه سلسيوس بر روي زنده ماني اسپرم متعلق به شخصي به نام اسپالازاني مي باشد. وي ويال‌هاي23 حاول مني پستانداران را در برف قرار داد و بعد از ذوب آنها در دماي اتاق توانست که اسپرم‌هاي زنده را مشاهده نمايد. عدم وجود تجهيزات مناسب براي کاهش دما به زير 30- درجه سلسيوس محققان را مجبور ساخت تا آزمايشات خود را به دماهاي بالاتر از 30- درجه سلسيوس محدود کنند. از اين رو گزارش هاي متعدد اوليه اي مبني بر انجماد موفقيت آميز مني پستانداران در دماهاي 13-، 17- و 23- درجه سلسيوس وجود دارد. با شروع قرن بيستم و پيشرفت تجهيزات براي کاهش دما تا 200- درجه سلسيوس، تلاشهاي اوليه براي انجماد اسپرم در پستانداران در دماهاي خيلي پايين تر با شکست مواجه شد. ايوانف با انجماد اسپرم اسب در دماي 100- درجهسلسيوس هيچ اسپرم متحرکي را مشاهده ننمود. اين در حالي بود که در دماي 15- درجه سلسيوس انجماد اسپرم اسب با موفقيت انجام شده بود(سالامون و مکسول، 2000).
چند سال بعد گزارشهاي موفقيت آميزي از انجماد اسپرم انسان بر روي يخ خشک24 (70- درجه سلسيوس)، نيتروژن مايع (196- درجه سلسيوس) و هليوم25 مايع (296- درجه سلسيوس) منتشر شد. با ادامه موفقيت پژوهشگران در انجماد اسپرم پستانداران، مطالعات در زمينه بهينه سازي اين تکنيک انجام شد. ماکسيمف نشان داد که سوسپانسيون‌هاي سلولي از بافتهاي گياهي در يک محلول حاوي گليسرول قادرند از اسپرم در فرآيند انجماد- ذوب محافظت کنند (سالامون و مکسول، 1995). بررسيهاي کامل تر آزمايشگاهي نشان داد که محلول يک مولار گليسرول ميتواند محافظت خوبي را از اسپرم پستانداران (خرگوش، خوک، گاو، قوچ و اسب) در فرآيند انجماد-ذوب نشان دهد. گليسرول در سطح 18 درصد اثرات سمي بر روي اسپر

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *