منابع و ماخذ مقاله صنعت دارو

ه در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول شود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود (هولت، 1984). بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرماتوزواهای با کیفیت بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول در حین انجماد اسپرم در سال 1949 میلادی توسط پولژ باعث شد که بتواند برای اولین بار اسپرم حیوانات را منجمد کند. اینکه چگونه گلیسرول باعث حفظ اسپرم در حین انجماد میشود یک پدیده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانیسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان میدهد. برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی میشود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی میشود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط میشود که درنتیجه غلظت الکترولیتهای آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستالهای یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد که در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظتهای نمک محافظت میشود(مکلاگین و همکاران، 1992). علاوه بر گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلنگلایکول هم استفاده میشوند که دارای وزن مولکولی کم هستند و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده7 نامیده میشوند.
منابع لیپوپروتئینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زردهی تخم مرغ، شیر یا لسیتینسویا برای جلوگیری از شوک سرما8 و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(بلکشاو، 1995). برای تقویت رقیقکنندهها معمولا از ترکیبات با منشا حیوانی نظیر زرده تخممرغ و شیر کامل استفاده میشود. این رقیق کنندهها قادرند احتیاجات مورد نیاز اسپرم را که در بخشهای قبلی ذکرشد، تامین کنند. زرده تخم مرغ نیز یک جزء معمول تشکیل دهنده محیطهای انجماد است و با عمل بر روی غشا سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت میکند، اما این رقیق کنندهها مشکلاتی نیز با خود دارند به طوریکه درسالهای اخیر بحثهای زیادی را به خود اختصاص دادهاند. یکی ازاین مشکلات، تغییرات زیاد درترکیبات آنهاست به طوریکه استاندارد سازی هر یک از اجزای وی‍ژه و مفید موجود در آن رقیق کننده بر خصوصیات انجمادی اسپرم را با مشکل مواجه میکند. علاوه بر این زرده تخم مرغ و شیر ممکن است حاوی آلودگیهای میکروبی باشند که با تولید سموم، ظرفیت باروری اسپرماتوزوا را شدیدا کاهش داده و حتی باعث از بین رفتن آنها شوند و از همه مهمتر اینکه باعث انتقال بیماریهایی مثل آنفولانزای مرغی شوند. از دیگر مشکلات زردهی تخم مرغ وجود مواد مضر از قبیل پروژسترون است که سبب ظرفیت دار شدن زود هنگام9 اسپرم در طی انجماد میشود. در محیط دارای زردهیتخم مرغ به علت وجود مواد اضافی، مشاهدات میکروسکوپی اسپرم دشوار است. همچنین مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرمها یا کاهش تحرک آنها میشود و نیز سموم اندوتوکسین تولیدی توسط آلودگیهای موجود در زرده تخممرغ باعث کاهش باروری اسپرم میشود. بنابراین آلودگیهای مایکوپلاسمایی و باکتریایی موجود در منابع حیوانی مورد استفاده در انجماد منی و گسترش منیهای منجمد گونههای مختلف در سطح جهان همواره نگرانی گسترش بیما‌ری‌هایی مانند جنون گاوی و آنفلوآنزای مرغی را در سطح جهان در پی داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: امیرات و همکاران، 2004). فراوانی منابع گیاهی و عدم وجود آلودگی منابع گیاهی این ضرورت را ایجاد میکند که این منابع جایگزین منابع حیوانی گردد، به طوریکه منابع گیاهی به ویژه لسیتینسویا در مطالعات زیادی برای انجماد اسپرم گونههای مختلف استفاده شده است که در فصل پیشینه تحقیق به طور کامل بررسی شده است.
1-3- هدف آزمایش
هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف زرده تخم مرغ و لسیتین سویا در رقیق کننده دست ساز و انتخاب بهترین سطوح لیپوپروتئینهای حیوانی و گیاهی در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد- ذوب بود. لسیتین سویا10 به عنوان منبع گیاهی و زرده تخممرغ به عنوان منبع حیوانی در یک محیط پایه11 برای انجماد اسپرم قوچ در نظر گرفته شدند. بنابراین اهداف این پژوهش شامل:
1- بررسی اثر غلظتهای مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1 و2%) روی جنبایی، زنده مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب
2- بررسی اثر غلظتهای مختلف زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و 20%) روی جنبایی، زنده مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب
3- تولید یک رقیق کننده دست ساز پایه و مطلوب برای انجام مطالعات بعدی انجماد منی
1-4-پرسش اصلی تحقیق (مساله تحقیق):
از بین دو نوع منبع لسیتین شامل زرده تخم مرغ و لسیتین سویا به عنوان محافظت کننده در برابر شوک سرما کدام یک از آنها و در چه سطحی جهت استفاده در محیط انجماد اسپرم قوچ افشاری در داخل فصل تولیدمثل مناسب هستند؟
فصل دوم
پیشینه تحقیق
2-1- حفظ انجمادی
حفظ انجمادی12 اسپرم ابزار مفیدی برای مطالعات جنین شناسی آزمایشگاهی و تلقیح مصنوعی13 است و بخش اساسی و ضروری در فناوری های تولید مثل به حساب می آید. حفظ انجمادی به معنای ذخیره مواد بیولوژیک از جمله اسپرم در زیر نقطه انجماد آب است، به گونهای که این مواد از بین نروند و جهت ذخیره طولانی مدت اسپرم برای لقاح آزمایشگاهی، مهندسی ژنتیک و تلقیح مصنوعی استفاده شود (ماتسوکا و همکاران، 2006).
2-1-1- کاربرد و فواید حفظ انجمادی منی
حفظ انجمادی یک روش حفظ ژرم پلاسم14 است که در بخشهای کشاورزی، آبزی پروری15، بیوتکنولوژی و حفظ گونههای در معرض انقراض کاربرد دارد(اندرابی و همکاران، 2007). در بخش کشاورزی، حفظ انجمادی ژرم پلاسم برای بهبود ژنتیکی گونههای اهلی، حفظ نژادهای کمیاب و مبادلات بین المللی ژرم پلاسم استفاده میگردد. هم چنین حفظ انجمادی ژرم پلاسم، برای تولید و حفاظت از حیوانات تراریخته16 ضروری است و در بسیاری از مطالعات پزشکی، به ویژه در زمینه ایمونولوژی، ویروسشناسی، نوروبیولوژی، سمشناسی و صنعت داروسازی کاربرد دارد. در مورد گونههای در معرض انقراض، حفظ انجمادی مواد ژنتیکی برای برنامههای مدیریت ژنتیکی آن گونهها و ذخیره منابع ژنتیکی استفاده میشود (هرارا و همکاران، 2006). در قوچ نشان داده شده است که منی منجمد ذخیره شده در طول 27 سال، باروری را تحت تاثیر قرار نمیدهد، که این باعث حفظ منابع ژنتیکی نژادهای بومی می‌شود(سالامون و ویزر، 1972). امروزه، حفظ انجمادی منی کاربردهای بیوتکنولوژیکی بسیاری دارد، از آن جمله که میتواند برای درمان مشکلات کم باروری17 انسان، بیماریهای تهدیدکننده حیات، حفظ منی و DNA گونههای در خطر انقراض و حفظ تنوع زیستی18 مورد استفاده قرار گیرد.
2-1-2- انواع روشهای حفظ انجمادی
دو روش میتواند برای حفظ انجمادی گامت استفاده شود: انجماد آهسته و انجماد سریع19. انجماد آهسته با استفاده از غلظت کم محافظت کنندهها انجمادی همراه است که به سمیت مواد شیمیایی و شوک اسمزی مرتبط است. انجماد سریع یا ویتریفیکاسیون یک روش سریع که باعث کاهش شوک سرمایی میشود، اما معمولا برای اسپرم انجام نمی‌شود، چون انتقال دما20 در سلولهای اسپرم خیلی آهسته است که امکان انجام ویتریفیکاسیون را بدون این که خطرات ناشی از اثرات محلول یا تشکیل بلورهای یخ را برای اسپرم داشته باشد، بدهد(بارباس و همکاران، 2009). معمولا، حفظ انجمادی شامل کاهش درجه حرارت، از دست دادن آب سلولی21، انجماد و ذوب میباشد(مک لاگین و همکاران، 1992). نرخ انجماد باید به اندازه کافی آهسته باشد تا اجازه دهد آب از سلولها توسط روش اسمز خارج شود تا از تشکیل کرسیتالهای یخ داخل سلولی که باعث صدمات برگشت ناپذیر به سلولهای اسپرم میشود، جلوگیری شود.
2-1-3- تاریخچه حفظ انجماد منی قوچ
مطالعات بر روی تلقیح مصنوعی در گوسفند، در ابتدای قرن بیستم توسط ایوانف آغاز شد. این مطالعات بر روی رقیق کنندهها و روشهای رقیق سازی منجر به کاربرد آزمایشی تلقیح مصنوعی در گوسفند شد. بعد از جنگ جهانی اول مطالعات گسترده تری تحت رهبری میلووانف آغاز شد و در اوایل سال 1930، تلقیح مصنوعی با استفاده از منی تازه و رقیق شده برای تولید انبوه گوسفندها با استفاده از منی قوچهای با نژاد برتر، انجام شد. بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچ های با نژاد برتر، نیازمند انتقال منی از مرکز تولید و جمع آوری به مزارع در فواصل دور است. همچنین امکان استفاده از اسپرم در زمانهای مختلف سال، مشوق محققان برای ذخیره اسپرم در شرایط آزمایشگاهی شد. برای این منظور باید از روشهاییاستفادهمیشدکه با کاهش یا توقف متابولیسم، عمر باروری22 اسپرمها افزایش می‌یافت(سالامون و مکسول، 2000). بر این اساس محققین دو راه برای ذخیره اسپرم پیشنهاد نمودند:
اولین روش بر اساس نگهداری آنها در حالت مایع و کاهش دما به 10-5 و یا 15-10 درجه سلسیوس بود. در این محدوده دمایی متابولیسم اسپرم به شکل برگشت پذیری متوقف میشود. زمانی که اسپرمها در دمای نزدیک به صفر درجه سلسیوس نگهداری شوند، شوک سرمایی میتواند تغییرات برگشت ناپذیری را در اسپرمها ایجاد کند و با افزودن لیپیدها به رقیق کننده و با سرد کردن تدریجی از دمای اتاق می توان مانع ایجاد شوک سرمایی در اسپرم ها شد. نگهداری در حالت مایع تنها برای نگهداری و ذخیره کوتاه مدت امکان پذیر بود. این امر موجب شد تا محققین روش‌های مبتنی بر کاهش دما به زیر صفر درجه سلسیوس، که در آن اسپرم مدت زمان بیشتری نگهداری می شود را جستجو کنند. مطالعات بر روی اثرات دمای زیر صفر درجه سلسیوس بر روی زنده مانی اسپرم متعلق به شخصی به نام اسپالازانی می باشد. وی ویال‌های23 حاول منی پستانداران را در برف قرار داد و بعد از ذوب آنها در دمای اتاق توانست که اسپرم‌های زنده را مشاهده نماید. عدم وجود تجهیزات مناسب برای کاهش دما به زیر 30- درجه سلسیوس محققان را مجبور ساخت تا آزمایشات خود را به دماهای بالاتر از 30- درجه سلسیوس محدود کنند. از این رو گزارش های متعدد اولیه ای مبنی بر انجماد موفقیت آمیز منی پستانداران در دماهای 13-، 17- و 23- درجه سلسیوس وجود دارد. با شروع قرن بیستم و پیشرفت تجهیزات برای کاهش دما تا 200- درجه سلسیوس، تلاشهای اولیه برای انجماد اسپرم در پستانداران در دماهای خیلی پایین تر با شکست مواجه شد. ایوانف با انجماد اسپرم اسب در دمای 100- درجهسلسیوس هیچ اسپرم متحرکی را مشاهده ننمود. این در حالی بود که در دمای 15- درجه سلسیوس انجماد اسپرم اسب با موفقیت انجام شده بود(سالامون و مکسول، 2000).
چند سال بعد گزارشهای موفقیت آمیزی از انجماد اسپرم انسان بر روی یخ خشک24 (70- درجه سلسیوس)، نیتروژن مایع (196- درجه سلسیوس) و هلیوم25 مایع (296- درجه سلسیوس) منتشر شد. با ادامه موفقیت پژوهشگران در انجماد اسپرم پستانداران، مطالعات در زمینه بهینه سازی این تکنیک انجام شد. ماکسیمف نشان داد که سوسپانسیون‌های سلولی از بافتهای گیاهی در یک محلول حاوی گلیسرول قادرند از اسپرم در فرآیند انجماد- ذوب محافظت کنند (سالامون و مکسول، 1995). بررسیهای کامل تر آزمایشگاهی نشان داد که محلول یک مولار گلیسرول میتواند محافظت خوبی را از اسپرم پستانداران (خرگوش، خوک، گاو، قوچ و اسب) در فرآیند انجماد-ذوب نشان دهد. گلیسرول در سطح 18 درصد اثرات سمی بر روی اسپر

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *