مهندسی کشاورزی - دامپروری

پایان نامه : بررسی الگوی بیان ژنی آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز

 واحد دامغان

 دانشکده کشاورزی

 پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد

در رشته مهندسی کشاورزی،گرایش بیوتکنولوژی کشاورزی

 عنوان:

بررسی الگوی بیان ژنی آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) در ریشه ی گیاه نیشکر

(  (Saccharum Lofficinarumتحت تنش شوری

 استاد راهنما:

جناب آقای دکتر محمدرضا تابنده

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر پیمان فروزش

جناب آقای دکتر شهرام رضوان بیدختی

متن پایان نامه :

فهرست مطالب

عنوانشماره صفحه
چکیده۱
فصل اول: مقدمه۲
فصل دوم: تاریخچه نیشکر در ایران و جهان۶
۲- تاریخچه نیشکر در ایران و جهان۷
۱-۲ تاریخچه نیشکر در جهان۷
۲-۲ تاریخچه نیشکر در ایران۷
۳-۲ اکولوژی نیشکر۹
۴-۲ مورفولوژی نیشکر۱۰
۱-۴-۲ ریشه۱۰
۱-۱-۴-۲ ریشه های سطحی۱۰
۲-۱-۴-۲ ریشه های میانی۱۰
۳-۱-۴-۲ ریشه های عمیق۱۰
۲-۴-۲ ساقه۱۰
۳-۴-۲ برگ۱۱
۴-۴-۲ گل۱۱
۵-۲ زمان کاشت قلمه های نیشکر۱۱
۶-۲ محصولات جانبی نیشکر۱۲
۷-۲ ارقام تجاری نیشکر۱۲
۱-۷-۲ رقم CP48-103۱۲
۲-۷-۲رقمCp57-614۱۲
۳-۷-۲ رقم Cp65-315۱۳
۴-۷-۲ رقم Cp69-1062۱۳
۵-۷-۲ رقم Cp70-321۱۳
۶-۷-۲ رقم Sp70-1143۱۴
۷-۷-۲ رقم Cp73-21۱۴
۸-۷-۲ رقم IRC99-01۱۴
۸-۲ بیماری های نیشکر۱۵
۹-۲ بیماریهای نیشکر ایران۱۵
۱-۹-۲ بیماریهای عفونی۱۵
۲-۹-۲ بیماریهای غیرعفونی۱۶
۱۰-۲ تنش های گیاهی۱۶
۱۱-۲ فیزیولوژی تنش های گیاهی۱۷
۱۲-۲ تنش های گیاهی از نظر موقعیت جغرافیایی و زیست محیطی در ایران۱۷
۱۳-۲ تنش شوری۱۸
۱۴-۲ علائم خسارت زای شوری۱۹
۱۵-۲ اثرات شوری بر گیاه نیشکر۲۰
۱۶-۲ مبانی سمیت سدیم۲۲
۱۷-۲ مکانیسم های تحمل شوری۲۳
۱۸-۲ سازوکارهای تحمل به شوری۲۴
۱۹-۲ سازگاری کل گیاه به تنش شوری۲۷
۱-۱۹-۲ تنظیم انتقال Na به اندام هوایی۲۷
۲۰-۲ مسیرهای اولیه ورود به ریشه۲۸
۱-۲۰-۲ مسیر حساس به Ca۲۸
۲-۲۰-۲ مسیرهای غیرحساس به Ca۲۹
۳-۲۰-۲ مسیر انحرافی۲۹
۲۱-۲ دقع Na به خارج از ریشه۳۰
۱-۲۱-۲ کنترل میزان برداشت خالص۳۰
۲-۲۱-۲ کنترل بارگیری آوند چوب۳۱
۲۲-۲ عوامل موثر در مقاومت گیاهان به شوری۳۱
۲۳-۲ مطالعات سلول شناختی و ژنتیکی۳۱
۲۴-۲ آنزیم فنیل آلانین آمونیا- لیاز۳۲
۲۵-۲ روش های ارزیابی بیان ژن۳۴
۱-۲۵-۲ روش لکه گذاری نورترن۳۵
۲-۲۵-۲ ارزیابی حفاظت در برابر R-Nase۳۵
۳-۲۵-۲ هیبریدیزاسیون درجا۳۶
۴-۲۵-۲ روش RT-PCR۳۶
۵-۲۵-۲ روش PCR در زمان حقیقی۳۶
۶-۲۵-۲ اصول PCR در زمان حقیقی۳۷
۷-۲۵-۲ روش های مختلف آزمون PCR در زمان حقیقی۳۹
۱-۷-۲۵-۲ روش مبتنی بر کاربرد رنگ های فلئورسنت آزاد۳۹
۲-۷-۲۵-۲ روش های مبتنی بر پروب۴۰
۳-۷-۲۵-۲ پروب های هیدرولیز شوند یا TaqMan۴۰
۴-۷-۲۵-۲ پروب های هیبرید شونده۴۱
۲۶-۲ اصول کاربرد PCR در زمان حقیقی در ارزیابی های کمی۴۲
۲۷-۲ روش عمومی برای محاسبه ی نسبت سنجش نسبی بیان ژن۴۳
فصل سوم: مواد و روشها۴۴
۱-۳ وسایل مورد استفاده۴۵
۲-۳ مواد مورد استفاده۴۵
۳-۳ روش کار۴۵
۱-۳-۳ نمونه گیری۴۵
۲-۳-۳ استخراج RNA۴۶
۱-۲-۳-۳ محلولهای مورد نیاز۴۶
۴-۳ واکنش سنتز CDNA (RT)۴۷
۱-۴-۳ روش ساخت CDNA۴۷
۵-۳ واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)۴۸
۱-۵-۳ روش تهیه محلول (PCR)۴۸
۲-۵-۳ تهیه ی ژل و ارزیابی محصول PCR۴۹
۳-۵-۳ روش تهیه ی محلول TAE۴۹
۴-۵-۳ ساخت رنگ بارگذاری۴۹
۵-۵-۳ بارگذاری نمونه ها۴۹
۶-۳ ارزیابی مقایسه کارایی تکثیرژن کنترل داخلی (GaPDH) و ژنPAL۵۰
۷-۳ واکنش PCR در زمان حقیقی۵۰
۱-۷-۳ روش انجام PCR در زمان حقیقی۵۰
۲-۷-۳ روش تهیه محلول PCR در زمان حقیقی۵۰
۸-۳ بررسی مقایسه ای بیان ژن ها۵۱
۹-۳ آنالیز آماری داده ها۵۱
فصل چهارم: نتایج۵۲
۱-۴ تعیین کارایی تکثیر ژن PAL و GAPDH۵۳
فصل پنجم: بحث۶۰
پیشنهادات۶۵
منابع فارسی۶۶
منابع خارجی۶۷

چکیده :

آنزیم فنیل آلانین (PAL) یکی از مهمترین آنزیمها در مسیر تولید پروپانوئیدها در گیاهان می باشد که نقش کلیدی در تولید این ترکیبات دارد. بیان ژن PAL در پاسخ به طیف وسیعی از محرک های محیطی شامل اشعه ی فرابنفش، دمای بالا و سایر شرایط تنشی افزایش می یابد. در این مطالعه تغییرات بیان ژن و فعالیت آنزیم PAL در ریشه، ساقه و برگ در نیشکر تحت ۳ تیمار تنشی ds/m 5/3-5/2 و ۶/۳-۶ و ۱/۶-۸ ارزیابی شد. بمنظور ارزیابی بیان ژن PAL از روش PCR زمان حقیقی رنگ SyberGreen و روش مقایسه ای ΔΔCt استفاده شد. همچنین ژن GAPDH بعنوان کالیبراتور در نظر گرفته شد. میزان فعالیت آنزیم بر اساس تغییر فنیل آلانین به ترانس سینامیک اسید و با بهره گرفتن از روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد.

نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش میزان شوری میزان بیان ژن PAL و فعالیت آن در بافت ریشه افزایش یافت. تغییرات یکسانی در بافت برگ و ساقه در پاسخ به شوری در بیان ژن و فعالیت آنزیم مشاهده گردید. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش میزان شوری میزان بیان ژن PAL و فعالیت آن در بافتهای مختلف نیشکر افزایش می یابد.

واژه های کلیدی: فنیل آلانین آمونیا لیاز، تنش شوری، نیشکر

نیشکر (Saccharum officinarum L.)از گونه Andropogoneae و جزء خانواده گندمیان و جزء گیاهان C4 بطور وسیعی در اطراف زمین در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری کشت می شود. نیشکر بعنوان منبع شکر و بسیاری فراورده های دیگر دارای اهمیت اقتصادی بالائی است و در مقایسه با سایر محصولات کشاورزی از نقطه نظر راندمان تثبیت انرژی در واحد سطح در درجه اول اهمیت قرار دارد. نیشکر حدود ۴۵ تن وزن خشک و ۲۲ تن شکر در هکتار در سال تولید می کند.

بخش جلگه اى خوزستان به علت دارا بودن شرایط مناسب از جمله: خاکهاى رسوبى(علی رغم وجود املاح شور)آب کافی، آفتاب درخشان روزهاى طولانى تنها منطقه در ایران است که نیشکر در آنجا بصورت انبوه کشت می شود، بنا به گفته بسیارى از مورخین رواج کشت نیشکر در ایران از زمان اشکانیان شروع شده است و اوج اهمیت نیشکر در خوزستان را قبل از اسلام و دوره ساسانیان باید جست.

اجرای طرح توسعه نیشکر در خوزستان آثار اقتصادىازجمله تامین شکر، کاغذ، تخته صنعتى (MDF)، فراهم آوردن امکانات تولید گوشت قرمز با بهره گرفتن از خوراک دام تولیدى، تولید محصولات بیوتکنولوژى ( مانند خمیر مایه، الکل و غیره ) و اشتغال زائی را در پی داشته است.

یکی از مشکلات کشاورزی ایران شوری اراضی است. حدود ۱۰ درصد خاکهای ایران را خاکهای شور و سدیمی تشکیل میدهند.افزایش میزان هدایت الکتریکی خاک به بیش از ۲ دسی زیمنس بر متر به عنوان شاخص شوری آب مطرح می باشد. گیاهان مقاوم به شوری در طبیعت به طرق مختلفی نسبت به این مشکل سازگاری یافته اند که شامل دامنه ای از تغییرات ریخت شناسی آناتومیکی و فیزیولوژیک می باشد. غالبا گیاهان باساخت ترکیبات مختلف بویژه ترکیبات پلی فنولی فشار اسمزی را تنظیم و در مقابل شوری مقاومت می کنند (برزگر و همکاران ۱۳۷۹).

کاهش آب رودخانه کارون در سالهای اخیر توام با افزایش سطح شوری خاکهای منطقه اثرات زیانباری بر صنعت کشت نیشکر بویژه کاهش تولید داشته است. اثر شوری بر عملکرد نیشکر با تفاوتهای نسبت به واریته های مختلف در مناطق جهان امری قطعی و بدیهی است. در گیاه نیشکر نیز شرایط مشابهی حاکم است. ساخت املاحی چون تری متیل سولفونیو پروپیونات،. فری پولین و برخی ترکیبات فنولیک در برگهای نیشکر تحت تنش اسمزی گزارش شده است. نیشکر در ردیف گیاهان حساس به شوری قرار گرفته و حد آستانه آن ds/m 7/1 است.بین افزایش شوری و رشد و تولید محصول نیشکر ارتباط معکوس وجود دارد. تنش شوری در نیشکر تمایز و طویل شدن میانگره ها و ذخیره قند را در آنها تحت تاثیر قرار می دهد. نتایج تحقیقات اخیر نشان می دهد که به ازا هر واحد افزایش در EC (ds/m) [1]سبب کاهش ۹/۵ تنی محصول در هکتار می­شود. در تحقیقات انجام شده درهفت تپه ایران مشخص شده است­که درمحدوده شوری بین ۴-۲ افت شدید عملکرد نیشکر اتفاق می­افتد. با این حال تفاوت گسترده­ای در پاسخ واریته های مختلف به شوری و میزان حساسیت و مقاومت آنها در ایران بدست آمده است (شکوه فر و همکاران، ۱۳۸۸) .

با توجه به اینکه آنزیم[۲] pal یک آنزیم تنشی و یکی از مهمترین آنزیم های مهم گیاه در تولید فرآورده های فنولی تنظیم کننده فشار اسمزی هستند. به نظر میرسد شناسایی تغییرات بیان ژن این انزیم در برابر تغییرات شوری بتواند شاخص دقیقی از پاسخ میزبان به این تنش را ایجاد نماید و بتوان بر اساس تغییرات بیان این آنزیم نسبت به شناسایی ارقام مقاوم اقدام نمود.

آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL, EC4.3.1.5) اولین واکنش درمسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئید را کاتالیز می کند و ال- فنیل آلانین را بصورت غیر اکسیداتیو دآمینه می کند. طی آن ترانس سینامیک اسید و یون آمونیم شکل می گیرد که ترانس سینامیک اسید پیش ساز ترکیبات متعددی مانند ترکیبات محافظ اسمزی می باشد.

در گیاهان پیشرفته ترانس سینامیک اسید پیش ساز طیف وسیعی از مشتقات فنیل پروپانوئیدها از قبیل فلاونوئید[۳]، استیلبن ها[۴]، کومارین ها[۵]، چوبها، چوب پنبه ها، سایر ترکیبات فنلی دیواره، استرها و آمیدهای محلول و برخی از آلکالوئیدها می باشد PAL ، سنتز و تجمع این ترکیبات در بافتها و گیاهان مختلف را تنظیم می کند و به این دلیل بطور مستقیم در تنظیم سیستم گردش، تجمع چوب و پاسخ در مقابل تخریب مکانیکی و عوامل بیماری زا دخالت دارد. این آنزیم به عنوان آنزیم اساسی در پدیده چوبی شدن دارای بیشینه مطالعات آنزیمی در ارتباط با متابولیسم ثانویه در گیاهان است و حدود یک درصد از کل پروتئین سلول گیاهی را تشکیل می دهد.

PALدر بسیاری گیاهان به عنوان یک ترکیب تترامر که توسط خانواده ژنی کوچکی با چهار عضو در آرابیدوپسیس (۴PAL -1PAL) کد می شود. PAL یکی از اولین ژنهای تدافعی گیاهان تشخیص داده شده است که بوسیله تنش های محیطی و عوامل بیماری زا تحریک می شود، همچنین نور، فیتوکروم و تنظیم کننده های رشد بیان این ژن را تحت تاثیر قرار می دهند.

میزان آنزیم PAL در گندمیان ازجمله ذرت غلظت بالائی در مقایسه با سایر گیاهان دارد.

نظربه اهمیت اقتصادی و صنعتی نیشکر در کشور و مشکلات اخیر این صنعت در ارتباط با افزایش شوری آب کارون در سالهای اخیر توام با کاهش تولید ناشی از این تنش ارزیابی شاخص های بیولوژیک پاسخ و شناسایی واریته های مقاوم بر اساس تفاوتهای بیولوژیک مولکولی ضروری می باشد. با توجه به اهمیت انزیم PAL در رشد و نمو و تولید ترکیبات بیولوژیک متعدد بویژه اسمو محافظ ها و عدم وجود اطلاعاتی در این خصوص بویژه در مورد گیاه نیشکر مطالعه مذکور طراحی گردید.

در این تحقیق تغییرات بیان ژن انزیم PAL در بافت ریشه واریته های نیشکر مقاوم به شوری مورد مطالعه قرار خواهد گرفت که به منظور مطالعه ی گسترده تر این تحقیق سنجش تغییرات بیان این انزیم در بافت های ساقه و برگ نیز مورد بررسی قرار گرفت که احتمالا نتایج حاصل از این تحقیق را می توان به منظور شناسایی ارقام مقاوم به شوری استفاده کرد.

  1. تاریخچه نیشکر در ایران و جهان

۱-۲٫ تاریخچه نیشکر در جهان

در رابطه با خاستگاه [۶]اولیۀ نیشکر، نظرات مختلفی وجود دارد. بعضی ها خاستگاه اولیۀ نیشکر را شرق هندوستان و قسمت های شمالی خلیج بنگال و برخی نخستین پایگاه آن را چین و تعدادی نیز زادگاه آن را جزایر اقیانوس آرام ( جزایر گینۀ نو) می دانند. انتقال اولیۀ نیشکر از قسمت های جنوبی اقیانوس آرام به جزایر گینه و کالدونیای جدید بوده، در حالیکه انتقال ثانویۀ آن از جنوب اقیانوس آرام به غرب و شمال غرب آسیا تا هندوستان و شبه جزیرۀ مالی و برمه صورت گرفت. بطور کلی یک منطقۀ مشترک آسیائی- استرالیائی برای منشا نیشکر قابل ارائه است. حد فاصل این منطقۀ مشترک از برونئو و جاوه در اسپانیا تا گینۀ نو در استرالیا است. حوزۀ آسیائی معرفی شده برای منشا نیشکر، بزرگترین حوزۀ ژنتیکی این گیاه بشمار می رود که شامل جزایر سوماترا، سواندا، جاوه، برونئو و جزایر متعدد اقیانوس آرام بوده که تا شرقی ترین نقطۀ جزیرۀ مالی امتداد دارد، در حالیکه مهمترین منطقه در حوزۀ استرالیائی تنوع ژنتیکی نیشکر جزیرۀ گینۀ نو است. مطالعات نشان داده که حوزۀ فیلیپین- مالزی نیز از مناطق مهم تنوع ژنتیکی نیشکر در محدودۀ مشترک آسیائی- استرالیائی آن بشمار می آید. به هر حال شواهد تاریخی دال بر آن است که این گیاه از ۱۵۰۰ سال پیش از میلاد مسیح در هندوستان کشت می شده و این هندی ها بوده اند که برای اولین بار توانسته اند شکر سرخ غیر متبلور( گور) را از نیشکر بدست آورند. زراعت نیشکر از هندوستان به سمت شرق تا چین توسعه یافت و در حدود قرن چهارم قبل از میلاد مسیح به سمت غرب هند تا ایران گسترش پیدا نموده و از همان زمان کشت آن در خوزستان مرسوم گشت. از اوائل قرن هشتم میلادی مقارن با اواخر قرن اول هجری، نیشکر از ایران به مصر برده شد و از این طریق به سوریه نیز وارد گشت. این گیاه در حدود اواسط قرن هشتم میلادی توسط مسلمانان به اسپانیا برده شد و از آنجا به سایر مناطق تحت تصرف مسلمانان در جنوب اروپا توسعه یافت. پس از خروج مسلمانان از اروپا، نیشکر به جزایر آزوور و قناری در اقیانوس اطلس برده شد. در اواخر قرن پانزدهم میلادی، کریستف کلمب در دومین سفر دریائی خود به آمریکا، نیشکر را از جزایر قناری به سنت دومنیکن برد و بدین طریق این گیاه به قارۀ امریکا نیز راه پیدا نمود (راهدار، ۱۳۸۳ ).

۲-۲ تاریخچه نیشکر در ایران

استان خوزستان از دیرباز مهد کشت نیشکر ایران بوده و نام فعلی آن نیز که به معنی شکرستان می باشد، برگرفته از سوابق دیرینه کشت این گیاه است. از جمله دلایلی که باعث استقرار این گیاه در منطقه شده، وجود خاک های حاصلخیز، آب فراوان، درجه حرارت مناسب و نور کافی می باشد (میرشکاری، ۱۳۸۱). بعضی از مورخین عقیده دارند که برای اولین بار نیشکر در زمان داریوش اول در اوایل قرن هفتم قبل از میلاد مسیح از هندوستان به ایران انتقال یافته است. نکته جالب آنکه استخراج شکر خام از نیشکر و تصفیه آنرا نیز به ایرانیان نسبت می دهند. بر این اساس شکر ایران، عربستان، حجاز و حتی ترکستان از طریق منطقه خوزستان تأمین می‌گشت. پس از ورود اسلام به ایران و تخریب هایی که در واحدهای زیر بنایی از جمله سد معروف شادروان شوشتر وارد آمد، کشت این گیاه رو به افول گذاشت و اوج این فاجعه در زمان استقرار حکومت عباسیان در ایران حادث شد که در عمل بسیاری از مزارع نیشکر کاری به شوره زار مبدل گشت و کار به جایی رسید که شکر ایران در قرن پنجم از مصر تأمین می شد. احیای مجدد کشت نیشکر ایران به سال ۱۳۱۶ هجری شمسی برمی گردد که دولت ایران تصمیم به احیای این زراعت نمود.  برای استقرار این گیاه در منطقه خوزستان قلمه هایی از کشورهای اندونزی، هند و مصر وارد و در منطقه آهودشت، اهواز و حمیدیه کشت شدند. در سال ۱۳۲۰ مساحت تحت کشت نیشکر ایران به ۳۰۰ هکتار رسید و آنالیز کیفیت شربت آنها نیز امیدوار کننده بود که متأسفانه بدلیل کارشکنی شرکت سابق نفت    ایران – انگلیس و شروع جنگ جهانی دوم باعث شد که مبادرت به احداث کارخانه تولید شکر نگردد. در سال ۱۳۲۸ سازمان برنامه و بودجه مجدداً در صدد انجام آزمایش نیشکر در خوزستان گردید. از کشورهای صاحب نام نیشکر کار از جمله آمریکا ، برزیل ، آرژانتین ، کوبا و . قلمه هایی را وارد و در اراضی شمال خوزستان کشت نمود. این اقدامات در سال ۱۳۳۰ با همکاری سازمان خواروبار کشاورزی جهانی (FAO)[7] تکمیل و نتیجه گرفته شد که خوزستان محل مناسبی جهت کشت نیشکر می باشد . در نهایت اولین کارخانه قند نیشکری ایران در سال ۱۳۴۰ در هفت تپه به بهره برداری رسید (بنی عباسی و پور مرعشی ،۱۳۶۶).

به استناد نتایج قابل قبولی که از فعالیت کشت و صنعت هفت تپه به دست آمد، کار مطالعات دومین واحد کشت و صنعت نیشکر ایران در سال ۱۳۵۰ آغاز و پس از چند سال،  فعالیت اجرایی آن در سال ۱۳۵۴ شروع شد. اولین بهره برداری این شرکت که کشت و صنعت کارون نامیده شد در سال ۱۳۵۶ اتفاق افتاد. در حال حاضـر بزرگترین واحـد کشت و صنعت نیشکر خاورمیانه به حساب می آید. با عنایت به آثار مثبت وجود شرکت های کشت و صنعت در رونق اقتصادی و ارتقاء شرایط اجتماعی منطقه بخصوص بحث اشتغال زایی آن که به نحوی مدیون صنایع جانبی آن نیز می باشد.  مطالعات دیگری جهت توسعه نیشکر در قالب ۷ واحد کشت و صنعتی جدید، ۲ واحد در شمال اهواز و ۵ واحد در جنوب آن، از سال ۱۳۶۵_۱۳۶۳توسط صندوق مطالعات نیشکر انجام پذیرفت .در نهایت منجر به آغاز عملیات اجرایی این واحدها بتدریج از سال ۱۳۷۰ گردید. در حال حاضر ۶ واحد از آنها به نام های کشت وصنعت امام خمینی (ره)، امیرکبیر، سلمان فارسی، دعبل خزائی، میرزاکوچک خان و فارابی به بهره‌برداری رسیده اند. فعالیت کشت و صنعت دهخدا نیز که از سال ۱۳۸۹ با جدیت آغاز شده، منتج به شروع بهره برداری آن در سال ۱۳۹۰ گردیذ. از طرفی همزمان با آغاز فعالیت های اجرائی شرکت توسعه نیشکر، واحدی دیگر بنام کشت و صنعت میان آب در سطحی معادل ۵۰۰۰ هکتار به بهره برداری رسیده، منتهی در حال حاضر فاقد کارخانه بوده و سالانه حدود ۳ تا ۲ هزار هکتار از اراضی خود را به زیر کشت نیشکر و مابقی را تحت کشت سایر محصولات کشاورزی برده و در نهایت محصول نیشکر خود را به کشت و صنعت های کارون و هفت تپه تحویل می دهد(راهدار، ۱۳۸۳).

99