زیست شناسی

پایان نامه : تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا به کمک Multiplex PCR

دانشکده علوم پایه

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی

گرایش میکروبیولوژی

عنوان:

تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا به کمک Multiplex PCR در موارد اسهالی ارجاعی به بیمارستان­های سبزوار

استاد راهنما:

دکتر علی اکبر جنت آبادی

استاد مشاور:

دکتررضا نظام زاده

متن پایان نامه :

چکیده.۲

فصل اول- مقدمه                                                                

   مقدمه وهدف۴

فصل دوم-ی بر تحقیقات گذشته                                          

۲-۱- خصوصیات سالمونلا.۸          

۲-۱-۱- تاریخچه۸          

۲-۱-۲- طبقه بندی.۹          

۲-۱-۳- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک.۱۰        

۲-۱-۴- حساسیت به مواد شیمیایی۱۲        

۲-۱-۵- ساختار پادگنی سالمونلا۱۲        

۲-۱-۶- روش های طبقه بندی۱۴        

۲-۱-۷- شرایط رشد سالمونلا.۱۵         

۲-۱-۸- بقا سالمونلا۱۷        

۲-۱-۹- منشا سالمونلا.۲۰        

۲-۲- آلودگی در انسان۲۱        

۲-۲-۱- میزان شیوع سالمونلوز در انسان۲۲

۲-۲-۲- علائم سالمونلوز در انسان.۲۳

۲-۲-۳- دوز آلوده کننده.۲۵

۲-۲-۴- پیشگیری.۲۵

۲-۳- سالمونلوز در حیوانات۲۶

۲-۴- سالمونلوز در پرندگان.۲۷

۲-۴-۱- آلودگی در طیور۲۷

۲-۴-۲- میزان شیوع.۲۸

۲-۵- روش های تشخیص سالمونلا۲۹

۲-۵-۱- روش های کشت.۲۹

۲-۵-۲- روش سرولوژیکی.۳۰

۲-۵-۳- روش الایزا ۳۰

۲-۵-۴- روش آگلوتیناسیون به کمک لاتکس. ۳۱

۲-۵-۵-۱-روشPCR 31        

۲-۵-۵-۲-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR. 31

۲-۵-۵-۳- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR.33

۲-۵-۵-۴-   اجزای PCR33

۲-۵-۵-۵- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا.۳۴

فصل سوم:مواد و روش ها .۴۴          

۳-۱- وسایل مورد استفاده۴۵

۳-۲- مواد مورد استفاده۴۶

۳-۳- گرد آوری نمونه های آزمایشی.۴۶

۳-۴-۱- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط.۴۶

۳-۴-۲- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه.۴۶

۳-۴-۳- کشت در محیط جامد انتخابی۴۷

۳-۵- آزمون های بیوشیمیایی.۴۷

۳-۵-۱- کشت در محیط آهن دار سه قندی.۴۷

۳-۵-۲- آزمون اوره آز ۴۸        

۳-۵-۳- آزمون وژس پروسکوئر۴۸

۳-۵-۴- آزمون اندول.۴۹

۳-۵-۵- آزمون سیترات۴۹

۳-۵-۶- آزمون حرکت۴۹

۳-۶- آزمون رنگ آمیزی گرم۴۹

   3-6-1- تهیه گسترش روی لام.۵۰

   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله۵۰

۳-۶-۳- مرحله شستشو.۵۱

   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید۵۱

   3-6-5- مرحله رنگ بری با بهره گرفتن از استن – الکل.۵۱

   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین.۵۱

   3-6-7- خشک کردن لام.۵۱

 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد .۵۱

   3-7- استخراج DNA52                                                                    

۳ -۷-۱-   مواد و وسایل لازم۵۲

۳-۸- آزمون PCR. 52                                                                                              

۳-۸-۱- مواد و وسایل لازم۵۲

۳-۸-۲- روش کار۵۳

۳-۹- الکتروفورز محصولاتPCR54                                                                  

۳-۹-۱- مواد و وسائل لازم۵۴      

۳-۹-۲- تهیه بافر ۱x55

۳-۹-۳- تهیه ژل آگاروز.۵۵

۳-۸-۴- بارگذاری محصولات .PCR55              

۳-۱۰- مشاهده باند های روی ژل۵۶                                                      

۳-۱۰-۱- مواد و وسایل لازم.۵۶

فصل چهارم :نتایج                                                                      

۴-۱ نتایج۵۸

۴-۲- کشت در محیط جامد انتخابی.۵۸

۴-۲-۱- کشت در محیط XLD 58                                                                            

۴-۲-۲-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار.۵۹

۴-۳-آزمون گرم.۵۹

۴-۴-تست های بیو شیمیایی۶۰

۴-۴-۱-آزمون .TSI60

۴-۴-۲-آزمون اوره آز۶۰

۴-۴-۳-آزمون VP.61

۴-۴-۵-آزمون اندول.۶۱

۴-۴-۶-آزمون سیترات. ۶۱

۴-۴-۷-آزمون حرکت.۶۲

۴-۵-استخراج DNA.63

۴-۵-۱-استخراج توسط KOH 5/0 مولار.۶۳

۴-۶-آزمونPCR63

۴ -۷-نتایج آزمون کای دو.۶۷

فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            

۵-۱- بحث۶۹

۵-۲- نتیجه گیری نهایی۷۷

۵-۳-پیشنهادات.۷۸

چکیده:

عفونت‌های سالمونلایی که عفونت های غذایی نامیده می‌شوند، ممکن است توسط هر یک از سرووارها ایجاد شود. معمولا باکتری عامل عفونت در ماده غذایی رشد می‌کند تا به مقدار قابل توجهی برسد. به این ترتیب احتمال عفونت افزایش یافته و موجب بروز بیماری در خانواده‌ها و گروه‌های بزرگ می‌شوند. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی‌های غذایی انسان و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را داراست. امروزه بیش از ۲۴۵۰ سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیت در انسان می‌باشند. در این مطالعه ۵۰ نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بیمارستان‌های شهرستان سبزوار جمع‌آوری گردید و با رعایت کامل موارد بهداشتی به آزمایشگاه تخصصی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار منتقل شدند. برای جداسازی اولیه از محیط کشت‌های بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گردید. جهت تایید تشخیص از تست‌های بیوشیمیایی نظیر TSI و اوره آگار و VP، اندول و سیمون سیترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر ۱۰ مورد باکتری سالمونلا با بهره گرفتن از روش کشت میکروبی جدا شد. این در حالی است که با بهره گرفتن از روش مولکولی Multiplex PCR ، ۲۱ مورد باکتری سالمونلا در نمونه‌ها ردیابی گردید. بنابراین می‌توان گفت که روش PCR نسبت به کشت میکروبی از دقت بالاتری برخوردار است و همچنین روش‌های سنتی کشت میکروبی اغلب زمان‌بر خسته‌کننده و پرهزینه است.

واژه‌های کلیدی: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع

 مقدمه و هدف:

در طول دهه گذشته وقوع بیماری‌ها و عفونت های با منشا غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه و با فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته و با استانداردهای بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده و این در حالی است که وقوع عفونت‌ها و مسمومیت‌های غذایی اغلب گزارش نشده باقی می‌ماند و لذا تعیین آمار دقیق از میزان ابتلا خصوصاً در کشورهای درحال توسعه امکان‌پذیر نمی‌باشد. غذا می‌تواند به عنوان یک حامل، بسیاری از میکروارگانیسم‌های عامل عفونی یا غیر عفونی را در خود حمل کند که در بعضی از شرایط، رشد عامل عفونی را حمایت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و یا تنها نقش ناقل غیرفعال را ایفا می کند که در این صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و یا تنها به وسیله‌ی غذا به انسان منتقل می‌شود. بیماری‌های غذایی جزء بیماری‌های روده‌ای تقسیم‌بندی می‌شوند که از نظر اهمیت در آمریکا بعد از بیماری‌های ریوی در مقام دوم قرار دارند. در یک بررسی در ایالات متحده گزارش شده که بطور مستقیم هر آمریکایی حداقل هر سال یکبار به بیماری‌های روده‌ای با علامت اسهال مبتلا می‌شوند. گفته می‌شود که این مسئله به خاطر ناسالم بودن غذای تولید شده در این کشور نیست بلکه مردم با عمل‌آوری غلط و غیربهداشتی و یا از طریق انتقال عوامل عفونی خود غذا را ناسالم می‌کنند (مهرور و همکاران،۱۳۸۵).

برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بیش از هزار میلیون مورد اسهال حاد در بین بچه‌های زیر پنج سال در کشورهای آمریکا، آسیا (به استثنای چین) و آمریکای لاتین اتفاق می‌افتد که به مرگ بیش از پنج میلیون نفر منجر می‌گردد. در کشورهای صنعتی مشکل کمتر از این‌هاست ولی به طور معنادار هنوز از اهمیت خاصی برخوردار است. طبق گزارش‌های موجود تنها در یک همه‌گیری آن هم در کشوری مثل آمریکا بیش از ۱۵۰۰۰ نفر در اثر مصرف شیرآلوده به سالمونلای مقاوم به آنتی‌بیوتیک مبتلا شدند. باکتری‌ها به عنوان مهم‌ترین عوامل در بروز بیماری‌های ناشی از مصرف غذا می‌باشند(اردستانی و همکاران،۱۳۸۶). از جمله این عوامل بیماری‌زا خانواده انتروباکتریاسه است(تاجبخش،۱۳۸۶). خانواده انتروباکتریاسه از تعداد زیادی باکتری گرم منفی تشکیل شده که قرابت بسیاری با هم دارند و در آب و خاک و مواد در حال فساد و گیاهان و دستگاه گوارش انسان و حیوانات و حشرات یافت می‌شوند. از آن جا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. باکتری‌های جنس سالمونلا گرم منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری، باسیلی شکل به اندازه‌ی ۵-۲ × ۵/۱ – ۷/۰ میکرون هستند که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشند (تاجبخش،۱۳۷۶).

از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند. این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است. اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا کرده و بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی ، بیماری‌هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند(زهرایی صالحی،۱۳۸۸). این باکتری‌ها معمولاً از طریق مدفوع انسان یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردند. انسان و حیوانات در بیشتر موارد در اثر مصرف این‌گونه مواد آلوده، باکتری را وارد دستگاه گوارش خود کرده و در نتیجه این گردش دهانی – مدفوعی تداوم می‌یابد(زهرایی صالحی،۱۳۸۸). باکتری سالمونلا انتریکا مهم‌ترین عامل در ابتلا به بیماری سالمونلوز در انسان می‌باشد به طوری که شیوع عفونت‌های سالمونلا انتریتیدیس به خصوص در دهه‌ی اخیر افزایش یافته است. فرد آلوده با سرووارهای سالمونلا انتریکا اغلب مبتلا به تب، دردهای ماهیچه‌‌های شکمی و اسهال می‌باشد. شروع این علائم از ۱۲ ساعت تا یک هفته پس از مصرف غذای آلوده ادامه دارد. این بیماری اغلب ۴ تا ۷ روز به طول می‌انجامد در بسیاری از افراد بدون درمان با آنتی‌بیوتیک بهبود می‌یابند. با این حال، اسهال می‌تواند شدید و گاهی اوقات منجر به بستری شدن افراد در بیمارستان گردد. بیماری در شیرخواران، کودکان و همچنین افراد مسن شدت داشته و نگران‌کننده می‌باشد. در مواردی بیماری می‌تواند به مرگ و میر در افراد حساس منجر شود(یوسفی مشعوف و همکاران ،۱۳۸۰) .

امروزه در آزمایشگاه‌های میکروب‌شنای از سه روش رایج جهت شناسایی و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.

۱- روش کشت سنتی و بیوشیمیایی که با تهیه نمونه و تهیه محیط کشت و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.

۲- روش‌ها سرولوژیکی: برپایه تشخیص آنتی‌ژن‌های تولید شده توسط باکتر (آنتی‌ژن O و H) است.

۳- روش‌های مولکولی: واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) یکی از رایج‌ترین روش‌های مولکولی است که بر اساس حضور ژن خاص و یا به عبارت دیگر قطعه‌ای از DNA است در این روش قطعه‌ای از ژن هدف تشکیل شده و وجود عامل پاتوژن اثبات می‌گردد. چندین ژن هدف در سویه‌های سالمونلا وجود دارد(,.,( InvA, spvC, InvB, OmpC(کارلسون و همکاران، ۲۰۰۴).

ژن InvA که برای تهاجم باکتری سالمونلا لازم است و بوسیله آن باکتری به قسمت‌های عمقی‌تر روده نفوذ می‌کند برای جنس سالمونلا اختصاصی است(گورین و همکاران،۲۰۰۵).

در این تحقیق که در دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار انجام گرفت بر روی نمونه‌های کلینیکی (مدفوع) با بهره گرفتن از محیط‌های اختصاصی سالمونلا و سپس با روش مولکولی Multiplex PCR به شناسایی عوامل پاتوژنی سالمونلا پرداختیم. هدف از این مطالعه ارزیابی تناسب ژن invA ،ompC و rfs به وسیله Multiplex PCR ،به عنوان روش اختصاصی برای تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا در نمونه های کلینیکی (مدفوع)بود . همچنین مقایسه روشPCR با روش های کشت سنتی و اختصاصی برای تشخیص سالمونلا بود.

۲-۱-خصوصیات سالمونلا :

۲-۱-۱-تاریخچه :

بیماری های ناشی از سالمونلا در انسان و حیوانات از زمانهای قدیم وجود داشته ولی تشخیص تفریقی آن از سایر بیماری ها مشکل بوده است. در جلد اول و دوم کتاب ارزشمند تاریخ دامپزشکی و پزشکی ایران تألیف استاد گرانقدر جناب آقای دکتر حسن تاج‌بخش به بیماری حصبه، تب مُطِبِقه و تب تیفوئید اشاره شده است. در اوایل قرن ۱۹ دو دانشمند فرانسوی به نامهای لوئی و کومل نشانه های بالینی و کالبدگشای تب تیفوئید را مورد بررسی قرار دادند(زهرایی صالحی،۱۳۸۸).

در سال ۱۸۳۷ گرهارد در اپیدمی تیفوس در فیلادلفیا دو بیماری تیفوس و تیفوئید را از هم متمایز ساخت. ادوارد جنر در بین سالهای ۱۸۴۹ـ۱۸۵۱ در بریتانیا از روی تجزیه و تحلیل نشانه‌های بیماری‌های تب‌دار، تب تیفوئید را تشخیص داد(زهرایی صالحی،۱۳۸۸).

99