مهندسی کشاورزی - دامپروری

پایان نامه : القاء موتاسیون نقطه‌ای با استفاده از EMS در گیاه بادرنجبویه Melissa officinalis

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده‌کشاورزی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد

دانلود مقاله و پایان نامه

رشته مهندسی کشاورزی بیوتکنولوژی کشاورزی

گرایش کشاورزی

عنوان

القاء موتاسیون نقطه‌ای با بهره گرفتن از EMS در گیاه بادرنجبویه Melissa officinalis

استاد راهنما

دکترسیدکمال کاظمی‌تبار

استاد مشاور

دکترجعفرمسعودسینکی

متن پایان نامه :

فهرست مطالب
صفحهعنوان
۱چکیده.
فصل اول: مقدمه و کلیات
۲۱-۱ مقدمه
۴۱-۱-۱ اهمیت موضوع.
۴۱-۱-۲ فرضیات.
۵۱-۱-۳ اهداف پژوهش.
۵۱-۱-۴ ساختارپژوهش.
۶۱-۲ کلیات
۶۱-۲-۱ گیاه شناسی
۷۱-۲-۲ رویش و تکثیر گیاه
۷۱-۲-۳ خواستگاه و دامنه انتشار.
۷۱-۲-۴ نیازهای اکولوژی
۸۱-۲-۵ اهمیت دارویی.
۸۱-۲-۶ مواد موثره و اجزاء اسانس.
۹۱-۲-۷ استفاده‌ها
۹۱-۲-۸ کشت بافت گیاهی.
۱۱۱-۲-۸-۱ تاریخچه کشت بافت گیاهی
۱۲۱-۲-۹ کاربردهای کشت بافت گیاهی
۱۲۱-۲-۹-۱ تولید مواد شیمیایی
۱۲۱-۲-۹-۲ ایجاد گیاه عاری از عوامل بیماری‌زای گیاهی
۱۲۱-۲-۹-۳ ایجاد تنوع ژنتیکی.
۱۲۱-۲-۹-۴ کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگل‌داری
۱۳۱-۲-۹-۵ کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی
۱۳۱-۲-۹-۶ کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی.
صفحهعنوان
۱۴۱-۲-۹-۷ انواع کشت بافت گیاهی
۱۴۱-۲-۹-۸ بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت
۱۵۱-۲-۹-۹ نمک‌های غیرآلی.
۱۵۱-۲-۹-۱۰ ویتامین‌ها.
۱۶۱-۲-۹-۱۱ هورمون‌های گیاهی.
۱۶۱-۲-۹-۱۱-۱ اکسین‌ها
۱۷۱-۲-۹-۱۱-۲ سیتوکنین‌ها.
۱۸۱-۲-۹-۱۲ منبع انرژی.
۱۸۱-۲-۹-۱۳ عوامل فیزیکی.
۱۸۱-۲-۹-۱۴ مواد آلی.
۱۹۱-۲-۹-۱۵ ریزنمونه
۱۹۱-۲-۹-۱۶ PH.
۱۹۱-۲-۹-۱۷ آب
۲۰۱-۲-۹-۱۸ آگار.
۲۰۱-۲-۹-۱۹ چگونگی انتخاب محیط کشت
۲۰۱-۲-۱۰ ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت
۲۱۱-۲-۱۰-۱ موارد استفاده از ریزازدیادی
۲۲۱-۲-۱۱ریشه‌زائی.
۲۲۱-۲-۱۲ تعریف موتاسیون (جهش).
۲۲۱-۲-۱۲-۱ تاریخچه استفاده از موتاسیون
۲۳۱-۲-۱۲-۲ انواع موتاسیون
۲۳۱-۲-۱۲-۳ موتاژن.
۲۴۱-۲-۱۲-۳-۱ انواع موتاژن
۲۴۱-۲-۱۲-۳-۲ عوامل شیمیایی جهش‌زا
۲۵۱-۲-۱۲-۴ سطوح ایجاد موتاسیون
صفحهعنوان
۲۶۱-۲-۱۲-۵ مواد گیاهی مورد تیمار
۲۶۱-۲-۱۲-۶ اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات.
۲۶۱-۲-۱۲-۷ هدف موتاسیون مصنوعی
۲۷۱-۲-۱۲-۸ موفقیت موتاسیون.
۲۷۱-۲-۱۲-۹ اصلاح به روش موتاسیون.
۲۷۱-۲-۱۲-۱۰ روش‌های جدید استفاده از موتاسیون.
۲۸۱-۲- ۱۳اسانس گیاهی.
۲۹۱-۲-۱۳-۱روغن‌های اسانس.
۳۰۱-۲-۱۳-۲ جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه.
          فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
۳۱۲-۱ اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف.
۳۳۲-۲ اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف.
۳۸۲-۳ کشت بافت.
          فصل سوم: مواد و روش‌ها
۴۰۳-۱ مواد گیاهی
۴۰۳-۲ کشت بافت.
۴۰۳-۲-۱ تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت
۴۱۳-۲-۱-۱ تهیه محلول ذخیره ماکرو.
۴۱۳-۲-۱-۲ تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو.
۴۳۳-۲-۱-۳ تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم
۴۳۳-۲-۱-۴ تهیه محلول ذخیره ویتامین
۴۴۳-۲-۲ تهیه محیط کشت
۴۵۳-۲-۳ کار در اتاقک کشت بافت.
۴۶۳-۲-۴ ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی
۴۶۳-۲-۴-۱ ضدعفونی نمونه‌های گیاهی.
صفحهعنوان
۴۶۳-۲-۳-۱ ضدعفونی اندام گیاه
۴۷۳-۲-۵ تهیه ریزنمونه
۴۷۳-۲-۶ بهینه سازی محیط کشت
۴۷۳-۲-۷ بررسی نمونه‌های کشت شده
۴۷۳-۲-۸ بازیافت کشت‌های آلوده
۴۸۳-۲-۹ تیمارهای مورد استفاده.
۴۸۳-۲-۹-۱ روش تهیه استوک EMS
۴۹۳-۲-۹-۲ روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی.
۴۹۳-۲-۹-۳ روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه.
۵۰۳-۲-۹-۴ روش شستشوی تیمارها
۵۰۳-۳ تهیه مواد گیاهی برای اسانس‌گیری.
۵۰۳-۴ آنالیز اجزاء اسانس
۵۱۳-۵ تجزیه داده‌های آماری.
         فصل چهارم: نتایج و بحث
۵۲۴-۱ کشت بافت.
۵۵۴-۲ تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه.
۵۶۴-۲-۱ ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی
۵۶۴-۲-۲ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی
۵۷۴-۲-۳ اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه
۵۷۴-۲-۴ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه.
۵۸۴-۲-۵ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ
۵۸۴-۲-۶ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه
۵۹۴-۲-۷ اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه.
۶۰۴-۲-۸ اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ
۶۰۴-۳ استخراج اسانس
صفحهعنوان
۶۰۴-۳-۱ آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس
۶۱۴-۳-۲ نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه
۶۲۴-۳-۳ ترکیبات تشکیل دهنده اسانس.
         فصل پنجم: نتیجه‌گیری
۶۳۵-۱ بحث.
۶۳۵-۱-۱ کشت بافت گیاهی.
۶۴۵-۱-۲ اثرات موتاژن EMS
۶۸۵-۲ نتیجه‌گیری
۶۹۵-۳ پیشنهادات.
۷۰فهرست منابع فارسی.
۷۴فهرست منابع انگلیسی
۸۶چکیده انگلیسی.

چکیده
بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis یکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. این پژوهش با قرار دادن ریز نمونه‌های بادرنجبویه به محیط کشت درون شیشه‌ای MS انجام شد و هدف تکثیر گیاه از طریق کشت بافت برای استفاده از تاثیر موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌های گیاهی جدید موتانت شده هم از طریق کشت بافت و هم در محیط مزرعه و بررسی تغییرات میزان مواد موثره اسانس موجود در گیاه در اثر ماده جهش‌زای اتیل متیل سولفانات (EMS) می‌باشد. این آزمایش هم بصورت مزرعه‌ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در تیمارهای آزمایشگاه، سرشاخه‌های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت‌های ۰/۰% (به عنوان شاهد)، ۰۵/۰% و ۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% EMS و در مدت زمان‌های ۲۴ و۴۸ ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیک از قبیل طول ساقه، طول ریشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ریشه رونده جانبی، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزیابی قرار گرفته و پاسخ معنی‌داری را در سطح ۵ درصد نشان دادند این آزمایش نشان داد که استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر مرفولوژیک این گیاه دارویی دارد. بهترین نتیجه نیز از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند و تحت تیمار با غلظت ۰۱/۰% EMS بودند به‌دست آمد. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متیل سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.
کلمات کلیدی: بادرنجبویه (Melissa officinalis)، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، اتیل متیل سولفانات(EMS)، مواد موثره
۱-۱ مقدمه:
گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند و در بسیاری از نقاط کشور رشد می‌یابند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با بهره گرفتن از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. در حال حاضر در قرن ۲۱، طب گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار است به گونه‌ای که در اتحادیه اروپا قوانینی مبنی بر لزوم انجام آزمایشات بالینی برروی گیاهان دارویی همانند داروهای شیمیایی وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهای گیاهی باید مجوز دریافت نمایند. اولین استفاده از گیاهان دارویی در خاورمیانه و مربوط به عصر پارینه سنگی است. شواهد استفاده از گیاهان دارویی توسط انسان به حدود شصت هزار سال پیش می‌رسد.
گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، ۱۳۷۷).
در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، ۱۳۸۵).
یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[۱] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.
استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند.در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با بهره گرفتن از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با بهره گرفتن از بیوتکنولوژی[۲] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[۳] و پلی پلوئید[۴] را نام برد.
کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[۵] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب بیگی و همکاران، ۱۳۸۵؛ سونانداکوماری و همکاران[۶]، ۲۰۰۳). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال ۱۷۵۶ توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[۷] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[۸]، ۱۹۹۴).
اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال ۱۹۰۲، بعد از آزمایش های وی روی کشت تک سلول ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[۹]، ۱۹۰۲). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه بادرنجبویه نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی

این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متیل سولفانات[۱۰] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.
۱-۱-۱ اهمیت موضوع
برای انجام کشت بافت بادرنجبویه (Melissa officinalis L) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، ۲۰۰۳؛ ساجانا و همکاران[۱۱]، ۲۰۱۱). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال ۱۹۷۶ توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، ۱۳۸۷).
بادرنجبویه به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی ،۱۳۸۶؛ هوشیار قیصر،۱۳۸۸). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره بادرنجبویه صورت گرفته است (رجحان،۱۳۶۲؛ زرگری،۱۳۶۹؛ مومنی وشاهرخی،۱۳۷۷؛ آزادبخت،۱۳۷۸). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت، بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابولیت‌های ثانویه ،انتقال ژن و مهندسی ژنتیک برای این گیاه ضرورت دارد.
۱-۱-۲ فرضیات
* کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه بادرنجبویه می‌باشد.
* بادرنجبویه در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.
* ایجاد جهش تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.
۱-۱-۳ اهداف پژوهش
در این پژوهش تلاش می شود اهداف زیر دنبال شود
*آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی بادرنجبویه و تکثیر آن در داخل شیشه.
* انتخاب بهترین و مناسب‌ترین نوع از انواع مخیط‌های مختلف کشت بافت
* بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در بادرنجبویه.
*بررسی تغییرات در خصوصیات مورفولوژیکی پس از اعمال جهش در گیاه بادرنجبویه.
* بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS
1-1-4 ساختار پژوهش
پژوهش حاضر در پنج فصل ارائه شده است. در فصل اول بیان کلی مسئله، هدف پژوهش و دلایل اهمیت موضوع، گیاه شناسی بادرنجبویه و خصوصیات مختلف آن می‌پردازد. همچنین مباحث مربوط به کشت بافت، تاریخچه و کاربرد آن و فاکتورهای موثر در کشت بافت به دقت مورد بررسی قرار می‌گیرد. در ادامه، مطالب مربوط به ایجاد جهش و اسانس‌گیری آن مطرح شده و در این میان به پژوهش‌های پیشین نیز اشاره خواهد شد.
فصل دوم شامل مروری بر تحقیقات و کارهای پژوهشی انجام شده در رابطه با کشت بافت و اعمال موتاژن‌ها بر روی گیاهان است.
فصل سوم شامل مواد و روش‌های مورد استفاده در پژوهش از جمله چگونگی ساخت محیط کشت MS و ویژگی‌های هر کدام از مواد مورد استفاده دراین محیط است. همچنین در ادامه به روش ضدعفونی کردن گیاه، تهیه ریزنمونه و چگونگی کشت کردن اشاره خواهد شد. روش اسانس‌گیری از گیاه نیز در این فصل مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
فصل چهارم به بیان نتایج بدست آمده از محاسبه آنالیزهای آماری نمونه‌های کشت شده و تحت تیمار قرار گرفته با غلظت‌های مختلف می‌پردازد.
فصل پنجم شامل چکیده‌ای از نتایج حاصل از این تحقیق و استدلال و بحث در مورد آنها می‌باشد و همچنین پیشنهادهایی در مورد کارهای آتی ارائه می‌دهد.
تعداد صفحه :۱۰۲
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

99