زیست شناسی

پایان نامه:بررسی اثر ژل آلوئه ورا بر روی فاکتورهای اسپرمی و تغییرات هیستوشیمیایی بیضه در موش های صحرایی دیابتی …

پایان ­نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته بافت وجنین شناسی

 

موضوع:

بررسی اثر ژل آلوئه ورا بر روی فاکتورهای اسپرمی و تغییرات هیستوشیمیایی بیضه در موش های صحرایی دیابتی شده با استرپتوزوتوسین

 

اساتید راهنما:

دکتروحیدنجاتی

دکترغلامرضا نجفی

 

استادمشاور:

دکترمینوایلخانی پور

 

شهریور۱۳۹۲

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

      فهرست مطالب

عنوان                        صفحه

فصل اول :مقدمه وکلیات

مقدمه و کلیات. ۸

۱-۱-مقدمه. ۸

۱-۲- تعریف و طبقه بندی دیابت. ۱۰

۱-۳- استرس اکسیداتیو و دیابت. ۱۰

۱-۳-۱مکانیسم تشکیل ROS در دستگاه تناسلی : ۱۱

۱-۴-پراکسیداسیون لیپیدی غشاء پلاسمایی اسپرم ها: ۱۱

۱-۵-آسیب دیدن حرکت اسپرم ها: ۱۲

۱-۶-آسیب به DNA اسپرم ها: ۱۲

۱-۷- ایجاد دیابت تجربی ۱۳

۱-۸- بافت شناسی بیضه. ۱۴

۱-۸-۱-لوله‌های منی ساز. ۱۵

۱-۸-۲-اسپرماتوژنز. ۱۵

۱-۸-۳-اسپرمیوژنز. ۱۶

۱-۸-۳-۱- ساختمان اسپرماتوزوئید. ۱۷

۱-۸-۴-اسپرم‌های غیر طبیعی ۱۸

۱-۸-۶-ماهیت دودمانی سلول‌های زایا ۱۸

۱-۸-۷-سلول‌های سرتولی ۱۹

۱-۸-۸-بافت بینابینی بیضه. ۱۹

۱-۹-تستوسترون. ۲۰

۱-۹-۱- اعمال تستوسترون. ۲۰

۱-۱۰-تولید جنین در شرایط In vivo. 20

۱-۱۰-۱-لقاح ۲۰

۱-۱۰-۲-نزدیک شدن گامت‌ها ۲۰

۱-۱۰-۳- آمیختن گامت‌ها ۲۱

۱-۱۰-۴- نتایج لقاح ۲۱

۱-۱۰-۵-تسهیم. ۲۲

۱-۱۰-۶-ظرفیت پذیری اسپرم. ۲۳

۱-۱۰-۷- لقاح آزمایشگاهی (IVF) 23

۱-۱۱-کلیاتی در رابطه با رت(موش صحرایی) ۲۵

۱-۱۱-۱-بلوغ. ۲۵

۱-۱۲-تاریخچه درمانی گیاهان. ۲۶

۱-۱۳-ویژگی های آنتی اکسیدانتی گیاهان. ۲۶

۱-۱۴-استفاده ازگیاهان در درمان بیماری دیابت. ۲۶

۱-۱۵-آلوئه ورا ۲۷

۱-۱۵-۱:تاریخچه ی آلوئه ورا ۲۷

۱-۱۵-۲-مشخصات ظاهری گیاه ۲۸

۱-۱۵-۲-۱-ترکیبات شگفت آور این گیاه چیست. ۲۹

۱-۱۵-۲-۲-دلایل عمده برای انتخاب وخواص مصرف ژل آلوئه ورا ۳۰

فصل دوم :مواد وروش کار

۲-۱- گروه بندی حیوانات. ۳۳

۲-۲ روش ایجاد دیابت تجربی ۳۴

۲-۳ نحوه اندازه گیری قند خون. ۳۴

۲-۴- نحوه تهیه ژل گیاهی ۳۵

۲-۵- نحوه تجویز عصاره به حیوان. ۳۵

۲-۶-نمونه برداری: ۳۵

۲-۷-بررسی قابلیت باروری آزمایشگاهی(IVF) 36

۳-۷-۱-آماده سازی اسپرم ها برای باروری آزمایشگاهی ۳۶

۲-۷-۲-آماده سازی محیط کشت برای IVF 36

۳-۷-۳- طرز تهیه محیط کشت جنین (mR1ECM) 36

۲-۷-۴-تخمک گیری از رتهای  ماده ۳۷

۲-۷-۵- عمل لقاح ۳۷

۲-۷-۶-ارزیابی رشد جنین ها ۳۷

۲-۸-نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم. ۳۸

۲-۹-  شمارش اسپرم ها ۳۸

۲-۱۰ بررسی قدرت زیست پذیری اسپرم. ۳۸

۲-۱۱- ارزیابی کیفیت کروماتین/DNA اسپرم توسط رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB) 39

۲-۱۲- بررسی میزان آسیب DNA اسپرم. ۳۹

۲-۱۳ آزمایشات بیوشیمیایی سرم. ۳۹

۲-۱۴-آزمایش  بیوشیمیایی بافت بیضه. ۴۰

۲-۱۴-۱-اندازه گیری میزان مالون دی-آلدئید (MDA) بافت بیضه. ۴۰

۲-۱۴-۲-سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: ۴۰

۲-۱۴-۳-اندازه گیری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام(TAOC) در بافت بیضه. ۴۰

۲-۱۵-بررسی بافت بیضه. ۴۱

۲-۱۶ رنگ آمیزی ۴۲

۲-۱۶-۱ رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین ۴۲

۲-۱۶-۲ مراحل مختلف رنگ آمیزی ۴۳

۳-۱۶-۳رنگ آمیزی در هماتوکسیلین ۴۳

۲-۱۶-۴رنگ آمیزی وان گیسن (Van Geison) 44

۲-۱۷- ارزیابی هیستومورفومتری بیضه. ۴۶

۲-۱۸-ارزیابی میزان اسپرماتوژنز در بافت بیضه. ۴۷

۲-۱۸-۱-شاخص ضریب تمایز لوله ای (TDI) 47

۲-۱۸-۲-ضریب بازسازی(RI) 47

۲-۱۸-۳-ضریب میوزی (MI) 47

۲-۱۸-۴-شاخص میزان اسپرمیوژنز (SPI) 47

۲-۱۹-روش بررسی آماری ۴۷

فصل سوم :نتایج

۳-۱-علائم بالینی ۴۹

۳-۲- بررسی تغییرات قندخون. ۴۹

۳-۳-نتایج مربوط به تغییرات وزنی ۵۱

۳-۳-۱ : نتایج مربوط به تغییرات وزن بدن. ۵۱

۳-۳-۲ : نتایج مربوط به تغییرات وزن بیضه. ۵۱

۳-۳-۳-یافته های مورفولوژیک بافت بیضه. ۵۲

۳-۳-۴-یافته های هیستومورفومتریک در بافت بیضه. ۵۶

۳-۳-۴-۱- تغییرات لوله های منی ساز. ۵۶

۳-۳-۴-۲- نتایج حاصل از مطالعه تعداد سلولهای لنفاوی در بافت بیضه(MNLCN) 57

۳-۳-۴-۳-نتایج حاصل از مطالعه تعداد سلولهای لیدیگ (LCN) 58

۳-۳-۵-نتایج حاصل از ارزیابی اسپرماتوژنز در بافت بیضه. ۵۹

۳-۳-۵-۱-نتایج حاصل از مطالعه ضریب میوزی(MI) 59

۳-۳-۵-۲-نتایج حاصل از مطالعه ضریب تمایز لوله ای (Tubular differentiation Index) 60

۳-۳-۵-۳-نتایج حاصل از مطالعه ضریب بازسازی (Repopulation Index) لوله های منی ساز. ۶۰

۳-۳-۵-۴-نتایج حاصل از مطالعه ضریب اسپرمیوژنز (SPI) 61

۳-۳-۵-۵-نتایج حاصل ازضریب سلول سرتولی(Sertoli cell index ) 61

۳-۵-بررسی سطح سرمی تستوسترون. ۶۲

۳-۶- مطالعه تغییرات مربوط به پارامترهای اسپرم. ۶۲

۳-۶-۱- نتایج حاصل از مطالعه درصد تعداد اسپرم های زنده در دم اپیدیدیم. ۶۲

۳-۶-۲-تحرک اسپرم. ۶۴

۳-۶-۲-۱نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای دارای تحرک پیشرونده((RPFM. 64

۳-۶-۲-۲-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای داری حرکت پیشرونده کند(SPFM) 64

۳-۶-۲-۳-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای داری تحرک درجا(RI) 65

۳-۶-۲-۴-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای فاقد تحرک(ML) 66

۳-۷-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای با کروماتین آسیب دیده ۶۶

۳-۸-نتایج حاصل از مطالعه درصد تعداد اسپرمهای نابالغ. ۶۸

۳-۹نتایج حاصل از مطالعه تعداد اسپرم. ۶۹

۳-۶-نتایج ارزیابی های بیوشیمیایی بافت بیضه. ۶۷

۳-۷- بررسی توان باروری ۶۹

۴-۷-۱-نتایج حاصل از تعداد اووسیتهای لقاح یافته. ۷۱

۳-۷-۲-نتایج حاصل از مطالعه درصد جنین های دو سلولی ۷۰

۳-۷-۳-نتایج حاصل از مطالعه درصد جنین های چهار سلولی ۷۱

۳-۷-۴-نتایج حاصل از مطالعه درصد بلاستوسیتها ۷۲

فصل چهارم:بحث

۴-۱-بحث. ۷۵

۴-۲-تغییرات وزنی وارتباط آن با دیابت. ۷۸

۴-۳-میزان گلوکزخون وارتباط آن با دیابت. ۷۶

۴-۴-وزن بیضه وارتباط آن با دیابت. ۷۶

۴-۵-هورمون تستوسترون وارتباط آن با بیضه ها در دیابت. ۷۷

۴-۶-تعداد سلول های لیدیگ وارتباط ان با میزان تستوسترون خون. ۷۸

۴-۷-ارتباط تعداد سلول های سرتولی با فرایند اسپرماتوژنز. ۷۹

۴-۸-پارامترهای مربوط به اسپرم وارتباط آنها با دیابت. ۸۲

۴-۹-ارزیابی بیوشیمیایی ۸۳

۴-۱۰-ارتباط بین کیفیت پایین اسپرم ها وتوان باروری آزمایشگاهی ۸۵

۴-۱۱-دیابت ویافته های مورفولوژیکی بیضه. ۸۴

۴-۱۲-نتیجه گیری ۸۵

۴-۱۳-پیشنهادات. ۸۶

چکیده ۸۹

منابع ۹۱

چکیده

بیماری دیابت یک اختلال متابولیکی است که به علت نقص در ترشح انسولین ویا ناتوانی بافت ها درپاسخ به انسولین ایجاد می شود.این بیماری در درازمدت باعث ایجاد آسیب دربافت بیضه ،کاهش کیفیت مایع منی کاهش سطح تستوسترون شده ودرنهایت منجربه ناباروری درمردان می شود.اخیراً از روش های گیاه درمانی برای درمان دیابت وپیشگیری ازاثرات پاتولوژیک آن در بافت بیضه استفاده می شود.بنابراین هدف این تحقیق ،ارزیابی اثرات محافظتی ژل آلوئه ورا دربافت بیضه است. بدین منظور،۴۸ سرموش صحرایی نربالغ در۶گروه کنترل،کنترل ژل آلوئه ورا با دوز mg/kg50،کنترل ژل آلوئه ورا بادوز mg/kg100،دیابتی (باتزریق استرپتوزوسین بادوز mg/kg60 )،درمان شده باژل بادوز mg/kg50(به طورگاواژ روزانه به مدت ۵۶ روز)،درمان شده باژل بادوز mg/kg100(به طورگاواژ روزانه به مدت ۵۶ روز)به طورمساوی تقسیم شدند.موش های گروه کنترل سالم وکنترل دیابتی روزانه ازطریق گاواژ دهانی ،نرمال سالین دریافت می کردند.پس از طی ۵۶ روز،تمامی موش ها کشته شده وبیضه آنهاتحت بررسی های بافتی قرار گرفت.سپس به منظورارزیابی پارامترهای اسپرم وانجام لقاح آزمایشگاهی (IVF)،نمونه های اسپرم ازدم اپی دیدیم جمع آوری شدند. به منظورارزیابی: تعداد لنفوسیت‌ها و سلولهای لیدیگ، و تعداد اسپرم‌ها، قابلیت زنده ماندن اسپرم‌ها (توسط رنگ هماتوکسیلین ائوزین)، بلوغ اسپرم‌ها (توسط رنگ آنیلین بلو)، آسیب  DNA در کروماتین اسپرم‌ها (توسط رنگ آکریدین اورنج) و تحرک اسپرم در موشهای نر بالغ انجام شد. سرانجام، بررسی اثر AVG بر میزان باروری آزمایشگاهی و علاوه بر این تاثیر بالقوه AVG  بر میزان مالون دی-آلدئید (MDA)،FRAP.Catalase, در مقاطع بافتی بیضه‌ها مورد بررسی قرار گرفت. غلظت سرمی هورمون تستوسترون  اندازه گیری شد نتایج بررسی های بافتی نشان دادند که قطرلوله های منی ساز،تعداد سلول های لیدیگ در یک میلی مترمربع بافت بینابینی بیضه ،میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام وسطح کاتالاز درگروه دیابتی در مقایسه با گروه های کنترل وگروه های درمان شده با ژل در سطح معنی داری کاهش یافته است.(P<0.05).دربررسی های پارامترهای اسپرم نشان داده شد که تحرک وقابلیت زنده ماندن اسپرم هاومیزان مالون دی آلدئید در گروه های درمان شده درسطح معنی داری (p<0.05) افزایش یافته است.ازطرفی درصد اسپرم هایی با DNAآسیب دیده،درصد اسپرم هایی باهسته نابالغ درگروه دیابتی نسبت به گروه های درمانی درسطح معنی داری(p<0.05) افزایش یافته است.همچنین ،نتایج حاصل ازلقاح آزمایشگاهی نشان داد که موفقیت باروری گروه های درمانی به ویژه در دوز mg/kg100درسطح معنی داری (p<0.05)افزایش یافته است.در گروه های درمانی نسبت به گروه دیابتی ،درصد اووسیت های بارورشده که تامرحله بلاستوسیت پیشرفت کرده بودند،درسطح معنی داری (p<0.05)بالا بود.ازطرفی ،بررسی های هماتولوژیکی نشان داد که میزان هورمون تستوسترون درگروه دیابتی درمقایسه باگروه های درمانی به ویژه در دوز mg/kg100،به طور قابل توجهی کاهش یافته است.نتایج حاصل نشان می دهندکه دیابت منجر به آسیب فرایندهای اسپرماتوژنز واسپرمیوژنز می شود.علاوه براین ،این بیماری باکاهش تعداد سلول های لیدیگ منجر به کاهش میزان تستوسترون خون می شود.درنهایت باکاهش کیفیت مایع منی ،میزان باروری کاهش می یابد.درضمن ژل آلوئه ورا ازطریق خاصیت آنتی اکسیدانتی وقابلیت کاهش قندخون ،آسیب های ناشی از دیابت راکاهش می دهد.بنابراین ،این ژل می تواند به عنوان یک ترکیب اختصاصی به منظور محافظت از بافت بیضه واسپرم در مقابل آسیب های ناشی از دیابت مورد توجه قراربگیرد.

کلمات کلیدی:دیابت،ژل آلوئه ورا،بیضه،اسپرم،لقاح آزمایشگاهی

فصل اول

مقدمه و کلیات

۱-۱-مقدمه

99