پایان نامه با واژه های کلیدی سرطان سینه، دانشگاه شیراز، نمونه برداری

(Osakina et al, 2014).
متاآنالیزی به کوشش Zhang و همکارانش در سال 2014 در مورد ارتباط چند شکلی GPX1 pro198leu با بیماریهای قلبی و عروقی به چاپ رسید. در این مطالعه افزایش قابل توجه خطر ابتلا به CVD با OR مساوی 84/1 در حضور لوسین در این جایگاه دیده شد (Zhang et al, 2014).
2-2- مطالعات انجام شده بر روی چند شکلی SOD1 A251G و ارتباط آن با بیماریهای گوناگون
در سال 2006 Oestergaard و همکارانش احتمال ابتلا به سرطان سینه را با 25 چندشکلی از 10 ژن از اعضا سیستم دفاع آنتیاکسیدانی در جمعیت انگلستان مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه ارتباط معناداری بین چند شکلی SOD1 A251G و سرطان سینه مشاهده نشد (Oestergaard et al, 2006).
پژوهشی در سال 2008 توسط Rajaraman و همکارانش بر روی چند شکلیهای ژنتیکی ژنهای مرتبط با استرسهای اکسیداتیو (CAT, GPX1, NOS3, PON1, SOD1, SOD2 & SOD3) و ایجاد تومور مغزی در بزگسالان انجام شد. در این پژوهش رابطه معناداری بین چند شکلیهای SOD1 A251G و GPX1 pro198leu و ابتلا به تومور مغزی در بزرگسالان مشاهده نشد (Rajaraman et al, 2008).
در سال 2010 مطالعهای توسط Liu و همکارانش بر روی ارتباط چندشکلیهای ژن SOD1 و از دست دادن شنوایی ناشی از صدا در کارگران چینی انجام شد. نتایج این مطالعه اثر حفاظتی ژنوتیپ AA را با 45/0OR= نشان میدهد (Liu et al, 2010).
مطالعهای در سال 2011 بر روی چند شکلیهای متفاوت ژن SOD1 و خطر ابتلا به NIHL21 در جمعیت هان توسط Li و همکارانش انجام شد. در این پژوهش الل G از چند شکلی A251G این ژن احتمال ابتلا به NIHL را افزایش میدهد (67/0OR=) (Li et al, 2011).
در سال 2011 مطالعهای بر روی چند شکلیهای 251A/G ژن سوپر اکسید دسموتاز، 21A/T- ژن کاتالاز و pro198leu ژن گلوتاتیون پراکسیداز و ارتباط آنها با آب مروارید وابسته به سن، توسط Zhang و همکارانش انجام شد. نتایج نشان میدهند که هیچ تفاوت قابل توجهی در بیماران نسبت به گروه کنترل برای چند شکلی GPX1 pro198leu وجود ندارد. این در حالی است که ژنوتیپ GG در چند شکلی SOD1 A251G باعث افزایش خطر ابتلا به آب مروارید وابسته به سن با OR مساوی 64/1 میشود (Zhang et al, 2011).
مطالعه دیگری توسط Kase و همکارانش در سال 2012 بر روی چند شکلی A251G ژن SOD1 و اثر آن بر nonsyndromic myelomeningocele صورت گرفت. نتایج این پژوهش نشان دهنده اثر حفاظتی الل G با OR برابر 66/0 بر روی استعداد ابتلا به این بیماری است (Kase et al, 2012).
در سال 2012 Zeng و همکارانش مطالعهای بر روی ارتباط میان چندشکلی SOD1 A251G و NIHLدر دو گروه ( به ترتیب در معرض 92-85 و بیش از 82 دسیبل) انجام دادند. نتیجه این مطالعه نشان دهنده اثر محافظتی ژنوتیپ AA به ترتیب با OR، 37/0 و 25/0 در این دو گروه است (Zeng et al, 2012).
2-3- مطالعات انجام شده بر روی رد حاد پیوند کلیه
پژوهشی در سال 2013 توسط Kim و همکارانش بر روی ارتباط چندشکلی TGFBR2 Asn389Asn (rs2228048) و رد حاد پیوند کلیه در کره انجام شد. در این مطالعه ارتباط معناداری بین این چند شکلی و افزایش ریسک رد حاد پیوند کلیه مشاهده شد(026/0 p=) (Kim et al, 2013).
در سال 2013 مطالعهای توسط Misra و همکارانش بر روی ارتباط رد حاد پیوند کلیه و ESRD با حذف و اضافه چهارده جفت باز در پروموتر ژن HLA-G صورت گرفت. در این مطالعه ارتباطی معنادار بین این چند شکلی و رد حاد پیوند کلیه و ابتلا به ESRD مشاهده شد به طوری که در بیماران فاقد رد حاد پیوند نسبت به افراد دارای رد حاد سطح بالاتری از HLA-G محلول دیده میشود (Misra et al, 2013).
مطالعهای توسط Mandegary و همکارانش بر روی اثر ژنوتیپ ژنهای TNF-α22 و IL-1023 فرد اهدا کننده با عملکرد تاخیری گرافت24 و رد حاد پیوند کلیه در سال 2013 صورت گرفت. در این مطالعه میان آلل A از چندشکلی TNF -308GA  با OR برابر 1/3 و DGF ارتباط معناداری مشاهده شد. نتایج نشان داد که اهدا کنندگان با تولید TNF بالا ممکن است خطر DGF در دریافت کنندگان را افزایش دهند (Mandegary et al, 2013).
پژوهشی توسط نکویی و همکارانش در سال 2013 در شیراز بر روی چندشکلی ژنتیکی GSTO2 (N142D) و خطر رد حاد پیوند کلیه انجام شد. در این مطالعه ارتباط معناداری میان این چندشکلی با ESRD و رد حاد پیوند کلیه مشاهده نشد. با این حال طبق نتایج این مطالعه، ژنوتیپ DD در بیمارانی که پیوند از اهداکننده جسد بر روی آنها صورت گرفته بود با 82/3OR= احتمال رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد (Nekooie-Marnany et al, 2013).
Pawlik و همکارانش در سال 2014 مطالعهای برای یافتن ارتباط رد حاد پیوند کلیه و چندشکلی ژنتیکی IVS3 +17T/C CD28 انجام دادند. این مطالعه ارتباط معناداری بین چندشکلی IVS3 +17T/C در ژن CD28 و رد حاد پیوند کلیه را نشان داد، به طوری که OR، CC+CT در مقابل TT برابر 93/1 بود (Pawlik et al, 2014).
در سال 2014 Chen و همکارانش پژوهشی در زمینه ارتباط رد حاد پیوند کلیه و چند شکلیهای ژنتیکی در ژنهای IL-2، IL-10، IL-2RB و TGF-β1 انجام دادند. میان این چند شکلیها و خطر رد حاد پیوند کلیه ارتباط معناداری مشاهده نشد (Chen et al, 2014).
فصل سوم
مواد و روش انجام کار
3-1-نمونه گیری
این مطالعه بر روی 262 بیمار پیوند کلیه از مرکز پیوند اعضا بیمارستان نمازی شیراز در سالهای 1390، 1391 و 1392 انجام شد. تمامی نمونهها به صورت خون کامل جمعآوری شده و در تیوبهای حاوی EDTA در شرایط دمایی چهار درجه سانتیگراد به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در این طرح تعداد 262 نمونه کنترل از پایگاه انتقال خون شیراز جمع آوری و طبق شرایط گفته شد به آزمایشگاه منتقل گردید. افراد سالم از نظر میانگین سنی و فراوانی جنسی با بیماران مطابقت داده شدند. رضایتنامه از بیماران و افراد سالم اخذ و انجام این مطالعه توسط کمیته اخلاق دانشگاه شیراز تایید شدهاست. در این پژوهش یک مطالعه مورد-شاهدی بین افراد سالم و بیماران پیوند کلیه و یک مطالعه بین بیماران پیوندی دچار عارضه رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. رد حاد در طول 6 ماه اول پس از پیوند با انجام بیوپسی (نمونه برداری از بافت) تایید میشود (Finkelstein et al, 1976).
جدول3-1: مشخصات افراد مورد مطالعه
بیماران پیوندی
کنترل
تعداد کل
262
262
میانگین سنی
2/14±3/42
6/13±9/42
3-2-وسایل مورد استفاده
وسایل استفاده شده در این مطالعه عبارتند از:
• سمپلر (ساخت Brand, Socorex )
• ترازو
• Rotator (ساخت پدیده نوژن پارس)
• میکروسانتریفیوژ (ساخت Hettich)
• Vortex (ساخت Scientific industries INC)
• Spine down
• دستگاه PCR (ساخت Techne)
• انکوباتور
• تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی (ساخت پایا پژوهش)
• دستگاه Gel Documentation (ساخت Uvitec Cambridge)
• اتوکلاو (ساخت ریحان طب)
• ماکروفر (ساخت بوتان)
3-3-مواد مورد استفاده
3-3-1: محلولهای لازم جهت استخراج DNA
• محلول NH4Cl (170 میلیمولار)
• محلول NaCl-EDTA (10 میلیمولار)
• محلول NaOH (50 میلیمولار)
• محلول Tris-HCl (1مولار)
3-3-2: مواد استفاده شده جهت انجام PCR
• بافر 10X (10X Buffer)
• MgCl2
• پرایمرهای رفت و برگشت برای ژنهای GPX1 و SOD1
• dNTP
• Taq Polymerase
همگی ساخت سینا ژن
3-3-3: مواد استفاده شده جهت انجام الکتروفورز
• بافر TBE (X 5/0)
• Agarose (ساخت Invitrogen)
• 6X Loading Buffer (سینا ژن)
• محلول اتیدیم برماید (X 1000)
• DNA Ladder 100bp (Vivantis)
• Boric acid (Merck)
• Tris base (Merck)
• EDTA (Merck)
3-3-4: مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
• آنزیمهای محدود کننده ApaI و MspI (ساخت Fermantas )
• B Buffer برای آنزیم ApaI
• Tango Buffer برای آنزیم MspI
3-4- استخراج DNA به روش جوشاندن (Boiling)
3-4-1: ساخت محلولهای مورد نیاز جهت استخراج
• برای ساخت محلول NH4Cl(170 میلیمولار) 1/0گرم NH4Cl را در 10 سیسی آب استریل حل شده و بلافاصله استفاده مورد استفاده قرار میگیرد.
• در تهیه محلول NaCl-EDTA (10 میلیمولار) 9/0 گرم EDTA و 146/0 گرم NaCl مورد نیاز هستند که در 250 میلیلیتر آب مقطر حل شده و pH آن به 5/7 رسانده میشود. این محلول پیش از استفاده باید اتوکلاو گردد.
• محلول NaOH (50 میلیمولار) از 5/0 گرم NaOH در 250 میلیلیتر آب مقطر تهیه شده و پیش از استفاده اتوکلاو شد.
• برای ساخت محلول Tris-HCl (یک مولار) 94/3 گرم Tris-HCl در 25 میلیلیتر آب مقطر حل شده و pH آن به 5/7 رسانده شد. این محلول نیز پیش از استفاده اتوکلاو گردید.
3-4-2: فرآیند استخراج به روش جوشاندن
فرآیند استخراج توسط محلولهای تهیه شده و با استفاده از 200 میکرولیتر خون براساس روش ارائه شده در منبع انجام شد (Newton, 1995 ).
3-5- تعیین ژنوتیپ با روش PCR-RFLP25
3-5-1: PCR
از واکنش زنجیرهای پلیمراز یا PCR جهت تعیین ژنوتیپ چندشکلیهای ژنتیکی ژنهای GPX1pro198leu و SOD1A251G استفاده شد. در جدول 1 شرح مواد مورد نیاز برای انجام یک واکنش PCR آمده است. به منظور انجام PCR ابتدا تمامی اجزا گفته شده در جدول به جز Taq polymerase از فریزر 20- درجه سانتی گراد خارج و در دمای اتاق قرار داده میشوند..
پس از ذوب شدن، تمامی اجزاء ورتکس شده و به یخ چهار درجه سانتیگراد برای انجام سایر مراحل انتقال داده میشوند. پس از اضافه شدن DNA الگو تیوبها توسط دستگاه، spin down شده و در دستگاه PCR قرار داده میشوند.
جدول 3-2: مواد مورد نیاز برای انجام PCR
اجزاء واکنش
میزان مورد نیاز برای هر واکنش (میکرولیتر)
10x buffer
5/2
MgCl2 (50 mM)
75/0
Forward primer (10 μM)
1
Reverse primer (10 μM)
1
dNTP (10mM)
5/0
Taq polymerase
3/0
آب استریل
95/13
الگو DNA
5
پرایمر رفت و برگشت، هر کدام برای انجام واکنش PCR ژن GPX1pro198leu به ازاء هر نمونه 6/0 میکرولیتر استفاده شده است. به همان نسبت میزان آب استریل برای هر نمونه به 75/14 میکرولیتر میرسد.
3-5-2: پرایمرهای مورد استفاده
• پرایمر برای ژن GPX1:
Forward primer: 5′-AAGGTGTTCCTCCCTCGTAGGT-3′
Reverse primer: 5′- CTACGCAGGTACAGCCGCCGCT-3′
)Paz-y-Miño et al, 2010(
• پرایمر برای ژن SOD1:
Forward primer: 5′-AGTACTGTCAACCACTAGC-3′
Reverse primer: 5′- ACAGCTCTTCAAACAAGGC-3′
(طراحی شده در آزمایشگاه)
3-6- تعیین ژنوتیپ برای چند شکلی GPX1pro198leu
به منظور تعیین ژنوتیپ این ژن از برنامه PCR طبق جدول 3-3 استفاده شد.
جدول3-3: برنامه تنظیم شده PCR برای تکثیر ژن GPX1 در 26 سیکل
مرحله
دما (°C)
زمان (ثانیه)
دناتوراسیون اولیه
94
300
دناتوراسیون
94
60
اتصال
60
60
طویل شدن
72
60
بسط نهایی
72
540
پس از اتمام PCR به هشت میکرولیتر از محصول آن 6/0 (U6) میکرولیتر آنزیم محدود کننده ApaI، 2 میکرولیتر B buffer و 4/17 میکرولیتر آب استریل اضافه شد. تیوبها به مدت سه ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از آن تیوبها اسپین شده و الکتروفورز انجام میشود.
محصول PCR برای چند شکلی ژنتیکی GPX1pro198leu یک

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *