منابع و ماخذ مقاله رقيق، زرده، مني

دانلود پایان نامه

م داشت(بيلفلد و همکاران، 1990). آزمايش مشهور پولژ و همکاران درسال 1949 منجر به کشف کامل خصوصيات حفاظتي گليسرول شد. کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول پيشرفت عظيمي در تکنيک انجماد اسپرم بود. بعد از پي بردن به خاصيت محافظتي گليسرول، آزمايشهاي متعددي بعد از سال 1950 بر روي انجماد اسپرم قوچ با رقيق کنندههاي حاوي گليسرول انجام شد.
2-1-4- مراحل حفظ انجمادي مني
پنج مرحله براي حفظ انجمادي مني وجود دارد:
1- رقيق سازي و مواجه شدن با مواد محافظ انجمادي
2- سرد کردن تا دماهاي 5-4 درجه سلسيوس
3- قرار گرفتن در معرض بخار ازت و سپس ذخيره سازي در ازت
4- ذوب مجدد و قرار گرفتن در دماي اتاق
5- حذف مواد محافظ انجمادي
2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ
حفظ انجمادي موفقيت آميز اسپرم تحت تاثير عوامل مختلفي است. از جمله اين عوامل مي توان به رقيق کننده، مواد محافظتي موجود در آنها، روش اضافه کردن اين مواد به رقيق کننده، نرخ سرد سازي و روش‌هاي ذوب اشاره نمود (اماموردي و همکاران، 2013). تلاشهاي قابل توجهي براي ايجاد روشهاي بهينه و ترکيب بهينهاي از اين عوامل جهت حفظ تحرک، سلامت و استحکام غشا بعد از انجماد-ذوب صورت گرفته است. هر کدام از اين عوامل با توجه به شرايط لازم براي دستيابي به بهترين نتيجه براي باروري اسپرم بعد از انجماد-ذوب دنبال ميشوند.
2-2-1- رقيق کننده ها
پلاسماي مني حاوي مقادير نسبتا بالايي از گليکوپروتئينها، گليکولپيدها و هورمونها ميباشد. اين مواد باعث محافظت از اسپرم بعد از انزال شده و انتقال اسپرم به دستگاه تناسلي ماده را تسهيل و باعث جلوگيري از ظرفيت يابي26 زود هنگام اسپرم مي شود. به هر حال پلاسماي مني تنها قادر است که به ميزان کمي از اسپرم در مقابل صدمات ناشي از سردسازي در فرآيند انجماد- ذوب محافظت نمايد. براي ذخيره سازي در دماهاي پايين نياز به رقيق کردن سيمن در رقيق کنندههاي خاص ميباشد. اين رقيق کنندهها بايد به طور کلي داراي اسيديته، ظرفيت بافرينگ27 و اسمولاريتي28 مناسبي باشند و بتوانند از اسپرم در مقابل صدمات ناشي از فرآيند انجماد-ذوب محافظت کنند(سالامون و مکسول، 2000). در ادامه به تعدادي از اين رقيق کننده ها که تاکنون مورد استفاده قرار گرفته اند به اختصار اشاره ميشود.
تريس (هيدروکسي متيل آمينومتان29) جزء اصلي رقيق کنندههاي امروزي براي انجماد مني گاو، قوچ و ساير گونهها ميباشد. اين بافر داراي ظرفيت بافرينگ و اسموتيک بسيار خوبي ميباشد و خاصيت سميت آن در مقايسه با ساير بافرها کمتر ميباشد. مطالعات متعدد نشان داده است که تريس به عنوان بهترين بافر براي رقيق سازي مني در اکثر گونههاي پستانداران عمل مي کند(سالامون و مکسول، 1995). بررسي مقايسهاي تريس به عنوان بافر رقيق کنندهها براي رقيق سازي و انجماد اسپرم قوچ نشان داد که بافر تريس در کنار گلوکز اثرات محافظتي بهتري نسبت به ساير قندها همچون فروکتوز، لاکتوز و رافينوز دارد(شانون و همکاران، 1995). البته تحقيقات بيشتر نشان داد که فروکتوز هم در کنار بافر تريس اثرات بهتري نسبت به ساير قندها دارد و اسپرم منجمد شده در رقيق کنندههاي بر پايه تريس، درصد بره زايي قابل قبولي را در مقايسه با ساير رقيق کنندهها نشان ميدهند.سالامون و همکاران نشان دادند که رقيق کنندههاي بر پايه تريس با 2% زرده تخم مرغ، جنبايي و کلاهک آکروزم اسپرم قوچ را پس از انجماد-ذوب تا حد قابل قبولي حفظ ميکند. بيشتر رقيق کنندههاي تجاري امروز که براي رقيق سازي مني گاو و گوسفند استفاده ميشود، بر پايه بافر تريس ميباشند.
2-2-3- مواد نگهدارنده يا محافظت کنندهها
2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولي يا نفود کننده
تمام روشهاي انجماد سلولي بر اساس استفاده از يک يا چند ماده محافظ انجماد است. لازمه يک محافظ انجمادي، بالا بودن قدرت نفوذ و سميت پايين30 آن ميباشد. گليسرول، دي متيل سولفوکسايد و اتيلن گليکول، عوامل محافظ انجمادي درون سلولي يا نفوذ کننده31 هستند، كه وزن مولکولي آنها نسبتا کم است. اين مواد از تجمع مولکولهاي آب با يکديگر براي تشکيل کريستالهاي يخ در درون اسپرم جلوگيري ميکنند و براي آبگيري آب داخل سلولي ضروري هستند. همچنين نقطه انجماد پايين آنها، زمان بيشتري براي آبگيري ايجاد ميکند. علاوه براين به عنوان حلال32، سبب حل شدن قندهاي غير قابل حل در محيط رقيق کننده ميشوند (عبدالحکيم و همکاران، 1991).
در طي فرآيند انجماد- ذوب، شوک سرمايي به شدت فسفولپيدهاي و گليکوپروتئينهاي موجود در سطح غشا را تحت تاثير قرار ميدهد و باعث شروع آسيبهاي ساختاري و بيوشيميايي ميشود. براي جلوگيري از اين آسيبها علاوه بر مواد محافظ درون سلولي، به مواد محافظ خارج سلولي يا نفوذ ناپذير نيز نيازمند است. اين مواد عمدتا ليپوپروتئينها و پروتئينهاي موجود در منابعي همچون زرده تخم مرغ، شير و منابع گياهي لسيتين سويا است. اين مواد با عمل بر روي غشاء سلولي، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت ميکند(سالامون و مکسول، 1995). استفاده از مواد محافظتي در غلظتهاي پايين ممکن است که براي حفاظت از اسپرم کافي نباشد و غلظت بالاي آنها نيز ممکن است که براي اسپرم سمي باشد. شرايط بهينه هر کدام از اين مواد محافظ براي دستيابي به بهترين باروي در ادامه دنبال ميشود. گليسرول معمول ترين ماده محافظ انجمادي است که قادر است به درون سلول نفوذ کند(سالامون و ويزر، 1972). کشف خصوصيات حفاظتي گليسرول توسط پولژ در سال 1949 تاثير بسيار عظيمي در تکنولوژي پيچيده انجماد اسپرم داشت. خاصيت حفاظتي گليسرول مربوط به توانايي برقراري پيوند آن با آب است و با افزايش حلاليت نمک در رقيق کنندهها باعث کاهش فشار اسمزي رقيق کننده مي‌شود. افزودن گليسرول به مني قبل از انجماد، شامل مرحله موازنه است كه در طي اين مرحله آب درون سلولي اسپرم بواسطه شيب اسمزي خارج شده و گليسرول جايگزين آن ميشود و بدين ترتيب مانع تشكيل كريستالهاي يخ درون سلولي شده و سلولها را در برابر آسيب حاصل از تشكيل كريستالهاي يخ محافظت ميکند.
علاوه بر گليسرول، چندين ماده محافظ درون سلولي ديگر نيز براي انجماد اسپرم پستانداران مورد بررسي قرار گرفته است. دي متيل سولفوکسايد وقتي که براي اولين بار به عنوان ماده جايگزين گليسرول مورد استفاده قرار گرفت، باعث کاهش تحرک و زنده ماني اسپرم بعد از انجماد- ذوب شد(هولت، 1994). با اين حال ترکيب 5/1 درصد دي متيل سولفوکسايد همراه با 7 درصد گليسرول در مقايسه با رقيق کننده حاوي تنها 5 درصد دي متيل سولفوکسايد بهتر بود(سالامون و مکسول، 1995). غلظت 2 درصد اتيلن گلايکول ميتواند از اسپرم در فرآيند انجماد- ذوب محافظت کند و اختلاف معني داري با رقيق کننده حاوي 5/3 درصد گليسرول از نظر تحرک و زنده ماني نشان نداد. در آزمايش ديگر حضور 5 درصداتيلن گلايکول در مقايسه با 5 درصد گليسرول در رقيق کننده سيمن قوچ باعث کاهش معني داري در زنده ماني اسپرم در گروه اتيلن گرديد. درصد بره زايي33 در ميشهاي تلقيح شده با اسپرم منجمد شده در رقيق کنندههاي حاوي 5/3 درصد گليسرول و 75/1 درصد اتيلن گلايکول اختلاف معني داري نشان نداد(سالامون و ويزر، 1972). در طول ساليان مختلف نگهدارندههاي متعددي براي رقيق سازي مني پستانداران مورد بررسي قرار گرفتهاند که هيچکدام از آنها نتوانستند همانند گليسرول عمل نمايند.
2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولي يا نفود ناپذير
زرده تخم مرغ
از سال 1939 وقتي که فيليپس و همکاران اثرات مثبت زرده تخم مرغ رابراي ذخيره سازي مني پستانداران کشف نمودند، زرده به عنوان يکي از اجزاي معمول در محيط انجماد اسپرم پستاندارن مورد استفاده قرار گرفت (فيليپس، 1939). زرده تخم مرغ، اسپرم را در برابر شوک سرمايي محافظت ميکند. زرده در سطح غشاي پلاسمايي سلول عمل ميکند و نقش آن بر خلاف گليسرول خارج سلولي است. علاوه بر اثرات مثبت زرده در طي فرآيند سرد سازي از دماي اتاق به دماي صفر درجه سلسيوس، در طي دوره انجماد نيز اسپرم از زرده براي محافظت از خود در برابر شوک سرمايي استفاده ميکند. جنبايي34، زنده ماني، سلامت آکروزوم و غشاي ميتوکندريايي اسپرم در طول استرسهاي فيزيکي و شيميايي ميتواند با حضور زرده در رقيق کننده تا حد قابل قبولي حفظ شود. زرده به عنوان يک بافر اسموتيک با حضور در رقيق کننده قادر است تحمل اسپرم را به هر دو نوع محيط هايپرتونيک و هايپوتونيک افزايش دهد. ثابت شده است که اثر محفاظتي زرده تخم مرغ براي اسپرم گاو بيشتر از قوچ است (سالامون و مکسول، 1995).
در مورد مکانيسم دقيق اثر زرده تخم مرغ اطلاعات دقيقي در دسترس نيست و فرضيههاي متنوعيدرباره اين اثر وجود دارد. ليپوپروتئينهاي با چگالي کم35 (LDL) بخش تاثير گذار زرده تخم مرغ است که با اتصال به غشاي اسپرم در طي فرآيند انجماد-ذوب، باعث مقاومت اسپرم در برابر آسيبهاي حرارتي مي‌شود(واتسون و همکاران، 1975). به هر حال نقش کامل پروتئينها و لپيدهاي موجود در LDL در برقراري پيوند و ارتباط با غشاي اسپرم هنوز به طورکامل مشخص نيست. همچنين LDL حاوي مقاديري فسفاتيديلکولين و فسفاتيدلسرين است که درطيفرآيند انجماد-ذوب به طور مرتب جايگزين فسفوليپدهاي از دست رفته غشاي اسپرم ميشوند(گيلان و همکاران، 2005). فسفولپيدها ميتوانند يک لايه محافظتي در اطراف غشاي اسپرم تشکيل دهند. اين پرده محافظتي در زمان شکسته شدن مولکولهاي LDL به وجود ميآيد(ولنته و همکاران، 2010). جذب و ژلاتينه شدن آپوپروتئينهاي36 LDL در اطراف غشاي اسپرم باعث تشکيل يک غشاي محافظتي در مقابل کريستالهاي يخ در اطراف غشاي اسپرم شود. فرضيهاي ديگر در اين مورد اين است که ليپوپروتئينهاي با چگالي کم با پپتيدهاي کاتتيونيک37 موجود در پلاسماي مني براي اتصال به غشاي اسپرم رقابت ميکند. اين پپتيدها که وزن مولکولي کمتر از 5 کيلو دالتون دارند، ميتوانند با اتصال به غشاي اسپرم باعث خارج شدن کلسترول از سطح غشا شوند(موکه و همکاران، 2008).
غلظتهاي مختلفي از زرده تخم مرغ دررقيق کنندهها براي انجماد اسپرم قوچ مورد بررسي قرارگرفته است. غلظتهاي 3 تا 50 درصد زرده براي رقيق سازي مني قوچ در آزمايشهاي مختلف نتايج متفاوتي داشته است. امروزه به طور کلي از غلظتهاي 15 تا 20 درصد زرده تخم مرغ در رقيق کنندهها براي رقيق سازي مني قوچ استفاده ميشود. ريتار و همکاران در آزمايشي نشان داند که درصد بره زايي در ميشهاي تلقيح شده با اسپرمهاي منجمد شده دررقيق کننده حاوي 3/1 و 12 درصد زرده مشابه است(روبايو و همکاران، 208). به هر حال غلظت اپتيمم زرده در رقيق کننده مني قوچ بستگي به اجزاء تشکيل دهنده رقيق کننده دارد. گرچه زرده تخم مرغ را بعضي مواقع مي توان با ماده ديگري با فعاليت مناسب جايگزين نمود، با اين حال در مورد انجماد مني قوچ، زرده به واسطه خاصيت محافظتي بر روي غشاي سلولي، يکي از اجزاي مهم محيط انجماد است. فروزانفر و همکاران در سال 2010 نشان دادند غلضت زرده تخم مرغ تا ميزان 20 درصد و غلظت گليسرول تا ميزان 7 درصد حجم کلي محيط انجماد، اثرات مثبتي بر روي توان حرکت اسپرم قوچ نژاد لري بختياري پس از انجماد- ذوب دارد. با وجود اثرات بسيار مثبت زرده تخم مرغ براي رقيق سازي مني در تمامي گونه هاي پستانداران، در سالهاي اخير استفاده از آن با مشکلاتي روبرو شده است و تلاشهايي در جهت حذف و يا کاهش مقدار آن در رقيق کنندهها صورت گرفته است.
الف- اثرات منفي زرده تخم مرغ
با وجود اثرات بسيار مثبت زرده تخم مرغ براي محافظت از اسپرم، در سالهاي اخير پژوهشگران به دنبال راهکاري براي حذف، استخراج بخش موثر و يا کاهش مقدار زرده تخم مرغ در رقيق کنندههاي مني پستانداران هستند. مهمترين بخش موجود در زرده تخم

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *